灰蓋鬼傘菌DSM-886固態發酵提高豆粕飼用價值的研究

徐浩 張寧 衛民 楊靜 樊洪玉 趙劍 解靜聰 蔣劍春

摘要?[目的]通過灰蓋鬼傘菌DSM-886固態發酵提高豆粕的飼用價值。[方法]利用灰蓋鬼傘菌菌絲體發酵工藝提高了豆粕的營養價值，并研究了發酵前后豆粕營養成分的變化。豆粕經灰蓋鬼傘菌固態發酵96 h后，分析其拮抗因子的變化，并通過對蛋白質的提取與分析，研究了發酵前后蛋白肽分布特性與氨基酸模式的變化。[結果]發酵過程消除了大豆粕中91%的胰蛋白酶抑制因子，組氨酸的總含量提高了217%，同時將豆粕中肽分子量降至20 ku以下。菌絲體發酵后的豆粕具有新的營養特性使之更能適應某些動物特別是幼畜的營養需求，同時發酵過程中產生的漆酶對黃曲霉毒素具有一定的降解作用，可提高飼料的安全性。[結論]作為蕈菌的典型菌株，灰蓋鬼傘菌的菌絲體發酵研究可為其他食用菌菌絲體的發酵過程提供參考。

關鍵詞?灰蓋鬼傘菌;食用菌;飼料;發酵;豆粕

中圖分類號?S816.6文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0091-03

大豆作為重要的糧食作物，同時也是食用植物油的主要來源之一，豆粕是大豆經過油脂提取后得到的副產物。豆粕含有豐富的植源性蛋白，是飼料工業主要的蛋白質來源[1]。與其他產油作物的加工剩余物相比，豆粕具有較高的粗蛋白含量（43.8%～47.5%）[2]。然而，由于氨基酸組成不平衡、存在營養拮抗因子以及適口性差等原因，豆粕并不適合作為水產動物飼料與幼畜飼料[3-6]。目前，提高豆粕飼用性能的主要研究方向是通過微生物發酵提高其植源性蛋白的可消化吸收性。研究表明，在諸多用于固態發酵的菌株中，米曲霉的發酵性能較為突出，通過米曲霉發酵過程可降低豆粕胰蛋白酶抑制因子84.4%、植源性蛋白肽分子量大小62.5%[7]。除了蛋白質的可消化吸收性外，氨基酸模式也是提高植源性原料飼用性能的重要因素。以白腐菌為代表的大型高等真菌具有高生物轉化率的同時，氨基酸模式也與動物性蛋白源更為接近。黃曲霉毒素同樣是衡量原料飼用價值的重要指標之一，白腐菌漆酶對黃曲霉毒素的降解有顯著效果[8]。根據德國TRBA標準與美國BSL生物安全等級標準，灰蓋鬼傘菌的安全級別均為1級，無潛在危害。灰蓋鬼傘菌作為白腐菌的典型菌株，具有生命周期短、菌絲生長快等特點，同時基因組中含有白腐菌中最大的漆酶家族以及多種抑菌蛋白，因此作為豆粕的飼用發酵菌株具有一定的研究價值[9]。 筆者通過灰蓋鬼傘菌DSM-886固態發酵試驗，分析了發酵前后豆粕的營養成分、氨基酸組成、豆粕蛋白肽分子量大小的分布等指標的變化。

1?材料與方法

1.1?菌種

灰蓋鬼傘菌DSM-886購自DSMZ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH）。

1.2?發酵方法

將干燥的豆粕與蒸餾水混勻，含水量為40%;于70 ℃條件下滅菌60 min，冷卻至室溫。滅菌后的豆粕接種灰蓋鬼傘菌孢子懸液10 mL/kg（約1.0×106個孢子）;37 ℃條件下固態發酵96 h。發酵結束后60 ℃條件下烘干至含水量約10%。

1.3?化學成分分析

化學成分分析項目包括水分含量（紅外水分測定儀OHAUS MB120）、粗蛋白含量（GB/T 6432—1994）、粗脂肪含量（GB/T 6433—2006）、粗灰分含量（GB/T 6438—2007）、氨基酸含量（Agilent 1200 SL ZORBAX Eclipse Plus C18 Columns）、胰蛋白酶抑制因子含量[10]、漆酶活性[11]以及發酵豆粕的消化與吸收性能[12]。

1.4?蛋白提取與分離

發酵豆粕與未發酵豆粕中蛋白的提取采用Faurobert[13]的方法。樣品經由分析用研磨機（A11 BASIC ANALYTICAL MILL 115 V，IKA-Laboratechnik）粉碎后，與20 mmol/L含有0.1%十二烷基硫酸鈉、5 mmol/L二硫蘇糖醇、5 μg/mL 蛋白酶抑制劑混合物（Promega）的 Tris-HCl buffer（pH 7.6）以1∶40的比例在冰上混勻5 min。混勻后的樣品在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min（Avanti JXN-30/26，Beckman，Fullerton，CA），取上清液1.5 mL，備用。蛋白質吸光度的測定使用BioRad Protein Assay Kit（產品編號500-0001）與分光光度計（UV-2550，Shimadzu）在595 nm波長下測定。標準曲線使用（產品編號500-0007，Bio-Rad）制作。蛋白分離采用SDS-PAGE方法[14]。取8 μg上清蛋白于90 mV條件下分離180 min。加入Coomassie Brilliant Blue R-250（BioRad）染色60 min后，放入10%醋酸、45%甲醇溶液中洗脫過夜。

1.5?數據統計與分析

蛋白印跡條帶使用UN-SCAN-IT-gelTM（version 6.1，Silk Scientific，Inc.，Orem，UT）軟件進行分析。

2?結果與分析

2.1?化學成分分析

由表1可知，經過96 h固態發酵，豆粕的主要營養成分發生改變。發酵后豆粕的粗蛋白含量較發酵前降低2.85%，粗脂肪含量較發酵前增加133.72%。高等真菌固態發酵過程中粗蛋白含量的降低往往是因為培養基的碳氮比較低，高等真菌的蛋白脫氨途徑被激活，在米曲霉發酵豆粕的研究中也存在同樣的現象[15-16]。脂肪含量的提高對于飼料營養的改善具有很高的價值，以食用菌為代表的大型真菌脂肪總類較為齊全，包括甘油單酯、甘油雙酯、甘油三脂、游離脂肪酸、甾醇、磷酸酯等，其中非飽和脂類含量占主要比例，可起到降低動物脂肪肝風險的作用[17]。胰蛋白酶抑制因子較發酵前同比降低91.10%，該水平下不再對飼用蛋白的吸收性產生拮抗效應[18-19]。發酵后漆酶酶活達1.46 U/g。體外試驗顯示，發酵豆粕的消化性與吸收性分別提高了12.44%和5.41%。

2.2?氨基酸模式分析

由表2可知，組氨酸含量的變化最為顯著，較發酵前提高了217.27%。組氨酸作為大多數魚類的必需氨基酸對鱸魚、黃魚、青魚等魚類的終末體質量和特定生長率有顯著影響[20]，對肉雞、鵝等禽類的養分利用率影響顯著[21]，同時可以改善大鼠的炎癥與氧化應激機制[22]。其他必需氨基酸中，精氨酸與賴氨酸含量的下降較為顯著，分別為63.59%和20.00%;總氨基酸含量較發酵前降低了5.26%。

2.3?蛋白印記分析

通過蛋白印記條帶分析豆粕發酵前后蛋白質分子大小的變化發現，發酵過程顯著改變了豆粕的蛋白特性。統計結果顯示，發酵前豆粕蛋白分子大小主要分布在40～60 ku（49.06%），大于60 ku的蛋白分子占28.97%，小于20 ku的蛋白分子占21.96%。絕大多數蛋白分子被降解到20 ku以下。由于幼齡動物的消化與分泌系統不完善，相對較小的蛋白分子量更有利于幼齡動物蛋白質營養的吸收[23-24]。

3?結論

（1）化學分析結果表明，灰蓋鬼傘菌DSM-886具有改善豆粕營養特性、降低飼料安全風險的能力，發酵后豆粕粗脂肪含量提高了133.72%，胰蛋白酶抑制因子降低了91.10%，漆酶酶活達到1.46 U/g;發酵豆粕的體外消化性與吸收性分別提高了12.44%與5.41%。

（2）氨基酸模式分析表明，該菌株可以顯著提高豆粕中組氨酸含量，固態發酵96 h組氨酸含量提高了217.27%。

（3）蛋白印跡條帶分析表明，該菌株發酵的豆粕可用于幼畜飼料的配制，固態發酵96 h豆粕蛋白質分子量降至20 ku以下。

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