常見海洋細菌對納米二氧化鈦的響應

陳嘉祥,王兆守*,邵宗澤

(1.廈門大學化學化工學院,福建 廈門 361005;2.國家海洋局第三海洋研究所,國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室,福建 廈門 361005)

納米材料因具有小尺寸效應、表面效應、界面效應和量子隧道效應等獨特的物理性質,表現出很多優異、全新的功能,進而被大量生產并廣泛應用于各個領域[1-2].TiO2具有良好的光催化特性,可殺滅細菌,還具有良好的熱穩定性和耐化學腐蝕性,因此,被廣泛應用于殺菌、顏料、涂料、化妝品、電子材料、食品添加劑、藥品以及生物醫學和工業生產等領域[3-5].納米TiO2是商業化生產最早、產量最高、應用范圍最廣的納米材料之一.2011—2014年世界商業生產的納米TiO2每年超過1 萬t[6].由于其高產量和高使用頻率,不可避免地會進入到海洋水體等生態環境中,其潛在的生態風險和對人類健康的影響已引起人們的廣泛關注.盡管目前有關環境中納米TiO2污染的研究還比較少,但已有研究表明納米TiO2可通過浸出和排放等形式進入地表水[6].

納米TiO2對部分水生生物有毒性作用.Ozaki等[7]在研究納米TiO2對人造水系沉積物中細菌群落豐度、活性和群落組成的影響后發現,納米TiO2的添加會導致細菌群落豐度快速下降.Zheng等[8]研究了納米TiO2顆粒對活性污泥的長期影響,發現活性污泥的表面結構沒有破損,這可能是活性污泥分泌的胞外多糖起到了保護作用,但是污水中50 mg/L 的納米TiO2顆粒顯著改變了活性污泥微生物的多樣性并且顯著降低了硝化菌的數量.另外,有學者研究了納米TiO2對大腸桿菌(Escherichiacoli)[9]、微藻[10]、水蚤、輪蟲和植物細胞[11]的毒性影響,然而納米TiO2對常見海洋細菌的影響尚未有系統的研究報道.為此,本文中選擇6種常見海洋細菌,研究其對納米TiO2的響應,以期為環境和生態系統的安全提供早期的預警,為應對水產品安全及資源環境問題提供科學支撐.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及培養基

本研究所用的菌株：海桿菌(Marinobactersp.) MCCC 1A00092,與M.hydrocarbonoclasticus相似性為94.64%,分離自泉州市近海海域;鹽單胞菌(Halomonassp.)MCCC 1A00533,與H.meridiana相似性為100%,分離自東太平洋海域;交替單胞菌(Alteromonassp.)MCCC 1A00576,與A.australica相似性為99.69%,分離自東太平洋海域;副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)MCCC 1A02609,分離自日本海域.均在中國海洋微生物菌種保藏中心(MCCC)保存.聚球藻(Synechococcussp.) XM-24和299,分別分離自廈門市近海海域和臺灣島近海海域,由廈門大學海洋與地球學院鄭強博士提供.枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)MCCC 1A00693和大腸桿菌CICC 10389,作為革蘭氏陽性和陰性模式菌,分別由MCCC和陳新華研究員課題組提供.

大腸桿菌采用LB培養基,聚球藻XM-24與299采用BG11培養基[12],其余細菌均采用2216E培養基.

1.1.2 試劑及儀器

納米TiO2(粒徑25 nm,Acros,美國)，T25細胞培養瓶、50 mL離心管和0.22 μm濾膜(美吉公司，上海).

能譜(EDS)分析儀和掃描電子顯微鏡(SEM)(Zeiss Sigma,德國),微生物生長曲線測定儀(AB Ltd,芬蘭),核酸蛋白測定儀(Biorad,美國),熒光顯微鏡(Nikon,日本).

1.2 實驗方法

1.2.1 納米TiO2母液的配制及表征

配制10 mg/mL的納米TiO2母液:稱取納米TiO2粉末,加入一定量超純水,121 ℃高壓滅菌20 min后,超聲30 min.

表征:取一定量的納米TiO2粉末加入到5 mL超純水中,經超聲分散后用毛細吸管吸取少量溶液滴加在潔凈的硅片上,在60 ℃烘箱中干燥,然后進行EDS和SEM分析.

1.2.2 菌體的活化與培養及生長指標的測定

1) 非光合細菌

將保存的菌種轉接到液體培養基中,適宜條件下培養24 h,取一定量菌液在固體培養基上活化培養24 h,再將新平板中單菌落挑取至相應液體培養基,適宜條件下培養至對數生長期,待用.在錐形瓶中各加100 mL培養基,滅菌后加菌液使其初始濃度約為1×106mL-1,再添加納米TiO2母液,使納米TiO2終質量濃度分別為0(對照組),0.1,1,10,100 mg/L,每個質量濃度設6個重復.在適宜溫度下(海桿菌和枯草芽胞桿菌為28 ℃,鹽單胞菌和交替單胞菌為20 ℃,副溶血弧菌為30 ℃,大腸桿菌為37 ℃),轉速120 r/min,分別在無光照和光照1 000～1 500 lx的條件下振蕩培養.

光照條件下培養的細菌,每隔6 h取樣,以相應質量濃度的納米TiO2(不含菌體)溶液為空白對照，采用核酸蛋白測定儀測定其在600 nm下的吸光度(A600)[13],并在光學顯微鏡下利用血球計數板進行計數.采用微生物生長曲線測定儀測定無光照條件下培養的細菌的生長曲線(以A600表示).

2) 光合細菌

將5 mL聚球藻液加入到含30 mL BG11培養基的T25細胞培養瓶中,光照1 000～1 500 lx,室溫25 ℃,光周期為12 h光照/12 h黑暗,培養7 d.在每天早10：00和晚10：00各搖勻2次,培養藻液至對數生長期,待用[14].通過A680值進行估算,將藻液稀釋至約5×107mL-1,取1 mL加入到50 mL BG11培養基中,加入納米TiO2母液使納米TiO2終質量濃度分別為0(對照組),0.1,1,10,100 mg/L,每個質量濃度設3個重復,在上述光照及溫度下連續培養.每隔3 d取樣1次,共4次.每瓶每次取藻液1 mL用于測定A680,取500 μL用于熒光顯微鏡計數,剩余藻液用于測定葉綠素a含量[15-16].

1.3 統計與分析

采用R軟件對實驗結果進行單因素方差分析(One-way ANOVA),p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著.

2 結 果

2.1 納米TiO2的表征

圖1為對納米TiO2元素組成和粒徑大小的表征結果.由圖1(a)可知,樣品含有Ti、O、C 3種元素,其中少量的C可能是制備納米TiO2過程中鈦酸四正丁酯(Ti(OC4H9)4) 水解產生的殘余.如圖1(b)的SEM結果所示,該納米TiO2的粒徑約為25 nm.

圖1 納米TiO2的EDS(a)和SEM(b)圖Fig.1 EDS spectrum(a) and SEM image(b) of nano-TiO2

2.2 納米TiO2對海桿菌生長的影響

(a)核酸蛋白測定儀測定；(b)細胞計數；(c)生長曲線測定儀測定.圖2 納米TiO2對海桿菌生長的影響Fig.2 Effect of nano-TiO2 on the growth of Marinobacter sp.

在光照培養下，納米TiO2對海桿菌生長影響的實驗結果如圖2(a)和(b)所示:經過18 h的光照培養,海桿菌對照組的生物量最高,其余各處理組的菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01);經過24 h的光照培養,100 mg/L處理組的生物量最低,菌體生長受到明顯抑制,與對照組和其余各處理組的差異極顯著(p<0.01).

如圖2(c)所示,在無光照培養下,取15 h(對數期)生長速率和20 h(穩定期)生物量增加量的數據進行統計學檢驗,可見100 mg/L處理組海桿菌的菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01).由于納米TiO2常溫下不溶于水,會產生光吸收,當納米TiO2質量濃度較高時,細胞可能與TiO2相互吸附、沉降,導致吸光度下降;而在數據分析時以相應質量濃度納米TiO2溶液(不含菌體)的光密度為空白對照,導致生長曲線中處理組在細菌生長停滯期的光密度為負值.

2.3 納米TiO2對鹽單胞菌生長的影響

納米TiO2對鹽單胞菌生長影響的實驗結果見圖3.如圖3(a)和(b)所示:經過18 h的光照培養,鹽單胞菌生物量以對照組最高,各處理組的菌體生長受到顯著抑制(p<0.05);經過24 h的光照培養,100 mg/L處理組的菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01).如圖3(c)所示,在無光照培養下,分析對數期(10 h)生長速率和穩定期(22 h)生物量增加量,可見100 mg/L處理組的鹽單胞菌生長受到極顯著抑制(p<0.01).

2.4 納米TiO2對交替單胞菌生長的影響

納米TiO2對交替單胞菌生長影響的實驗結果見圖4.如圖4(a)和(b)所示:經過18 h的光照培養,各處理組的菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01);經過24 h的光照培養,100 mg/L處理組的生物量最低,菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01).如圖4(c)所示,在無光照培養下,100 mg/L處理組的交替單胞菌對數期(5 h)的生長速率最低,可見菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01).

2.5 納米TiO2對副溶血弧菌生長的影響

(a)核酸蛋白測定儀測定；(b)細胞計數；(c)生長曲線測定儀測定.圖3 納米TiO2對鹽單胞菌生長的影響Fig.3 Effect of nano-TiO2 on the growth of Halomonas sp.

(a)核酸蛋白測定儀測定;(b)細胞計數;(c)生長曲線測定儀測定.圖4 納米TiO2對交替單胞菌生長的影響Fig.4 Effect of nano-TiO2 on the growth of Alteromonas sp.

(a)核酸蛋白測定儀測定;(b)細胞計數;(c)生長曲線測定儀測定.圖5 納米TiO2對副溶血弧菌生長的影響Fig.5 Effect of nano-TiO2 on the growth of V. parahaemolyticus

納米TiO2對副溶血弧菌生長影響的實驗結果見圖5.如圖5(a)和(b)所示:分別經過6和12 h的光照培養,100 mg/L處理組的副溶血弧菌生物量與其他處理組出現顯著差異,菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01);0.1 mg/L的納米TiO2對副溶血弧菌的生長不但沒有抑制作用,反而有一定的促進作用(圖5(a));經過24 h的光照培養,高質量濃度(10和100 mg/L)處理組的菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01)(圖5(b)).如圖5(c)所示,在無光照培養下,穩定期(15 h)時10和100 mg/L處理組的副溶血弧菌生物量增加量均降低，可見菌體生長受到顯著抑制(p<0.05).

2.6 納米TiO2對大腸桿菌生長的影響

納米TiO2對大腸桿菌生長影響的實驗結果見圖6.如圖6(a)和(b)所示:經過18 h的光照培養,100 mg/L處理組的大腸桿菌生物量最低,菌體生長受到顯著抑制(p<0.05),10 mg/L處理組的菌體生長也受到顯著抑制(p<0.05)；經過24 h的光照培養,100 mg/L處理組的菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01).如圖6(c)所示,在無光照培養下,對數期(5 h)處理組的生物量與對照組無顯著差異(p>0.05);穩定期(15 h)100 mg/L處理組的菌體生長受到顯著抑制(p<0.05).

2.7 納米TiO2對枯草芽胞桿菌生長的影響

(a)核酸蛋白測定儀測定;(b)細胞計數;(c)生長曲線測定儀測定.圖6 納米TiO2對大腸桿菌生長的影響Fig.6 Effect of nano-TiO2 on the growth of E. coli

(a)核酸蛋白測定儀測定;(b)細胞計數;(c)生長曲線測定儀測定.圖7 納米TiO2對枯草芽胞桿菌生長的影響Fig.7 Effect of nano-TiO2 on the growth of B. subtilis

納米TiO2對枯草芽胞桿菌生長影響的實驗結果見圖7.如圖7(a)和(b)所示:經過18 h的光照培養,1 mg/L處理組的枯草芽胞桿菌生物量最高,此時納米TiO2不但沒有抑制作用,反而有顯著促進菌體生長的作用(p<0.05);經過24 h的光照培養,對照組的生物量最高,各處理組的菌體生長受到顯著抑制(p<0.05),其中100 mg/L處理組的生物量最低,菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01).如圖7(c)所示,在無光照培養下,無論處于對數期(12 h)或穩定期(20 h),100 mg/L處理組的菌體生長均受到極顯著抑制(p<0.01).

2.8 納米TiO2對聚球藻生長的影響

納米TiO2對聚球藻299生長影響的實驗結果見圖8.經過6 d的培養,處理組與對照組、各處理組間均存在顯著差異(p<0.05)(圖8(a));經過9 d的培養,高質量濃度(10和100 mg/L)處理組的菌體生長受到顯著抑制(p<0.05);經過12 d的培養,100 mg/L處理組的菌體生長受到極顯著抑制(p<0.01);此外,在培養的中后期(9～12 d),0.1 mg/L的納米TiO2對聚球藻299的生長不但沒有抑制作用,反而有顯著促進生長的作用(p<0.05)(圖8(b)).

通過測定葉綠素a含量(圖8(c))發現:經過6 d的培養,0.1 mg/L處理組菌體的葉綠素a含量顯著升高(p<0.05);經過9 d的培養,100 mg/L處理組菌體的葉綠素a含量顯著降低(p<0.05);經過12 d的培養,各處理組間菌體葉綠素a含量無顯著差異(p>0.05).可見低質量濃度納米TiO2處理在短時間內會促進葉綠素a的合成,但當聚球藻299逐漸適應該質量濃度納米TiO2時,葉綠素a的合成反而略被抑制,因此其含量降低.

(a)核酸蛋白測定儀測定OD680;(b)細胞計數;(c)葉綠素a含量測定.圖8 納米TiO2對聚球藻299生長的影響Fig.8 Effect of nano-TiO2 on the growth of Synechococcus sp. 299

(a)核酸蛋白測定儀測定OD680;(b)細胞計數;(c)葉綠素a含量測定.圖9 納米TiO2對聚球藻XM-24生長的影響Fig.9 Effect of nano-TiO2 on the growth of Synechococcus sp. XM-24

與納米TiO2對聚球藻299生長影響的結果類似,納米TiO2對聚球藻XM-24生長影響的實驗結果見圖9.如圖9(a)和(b)所示,經過6 d的培養,處理組聚球藻XM-24的生物量隨納米TiO2質量濃度的升高而顯著降低(p<0.05);經過9～12 d的培養,高質量濃度(10和100 mg/L)處理組的菌體生長受到顯著抑制(p<0.05).在培養后期(12 d),高質量濃度(10和100 mg/L)處理組的葉綠素a含量顯著降低(p<0.05)(圖9(c)).

3 討 論

本研究表明,高質量濃度(100 mg/L)納米TiO2對海桿菌、鹽單胞菌、交替單胞菌、副溶血弧菌4種常見海洋非光合細菌，光合細菌聚球藻XM-24和299以及枯草芽胞桿菌和大腸桿菌2種模式細菌的生長均產生顯著的抑制作用(p<0.05);而低質量濃度(0.1和1 mg/L)納米TiO2未有顯著抑制作用,其中,0.1 mg/L納米TiO2對聚球藻299和副溶血弧菌的生長有一定促進作用，1 mg/L納米TiO2對枯草芽胞桿菌的生長有一定促進作用.納米TiO2對非光合細菌生長的抑制一般在18 h后顯著顯現(p<0.05);而對2種聚球藻生物量的影響則在6 d之后較為顯著(p<0.05).

Erdem等[17]研究表明,納米TiO2毒性與其粒徑大小有關,粒徑小于40 nm時其抑菌能力較強,且粒徑越小抑菌效果越明顯.Priyanka等[18]提出納米材料抑菌作用是在光照條件下完成的.本研究結果顯示,無論光照與否,在一定質量濃度范圍內,納米TiO2對細菌均有一定抑制作用,這表明光照并非是納米材料抑菌的必要條件.但本文中并未比較光照與非光照條件對細菌抑制作用的大小,這有待進一步研究.

本研究表明，高質量濃度(10和100 mg/L)納米TiO2對常見海洋細菌的影響顯著,這與已有的非海洋細菌的研究結果類似.Priyanka等[18]的研究表明質量濃度大于100 mg/L的納米TiO2在光照條件下對大腸桿菌MTCC 443和枯草芽胞桿菌MTCC 10619產生抑制作用.Erdem等[17]的研究表明,質量濃度為100～1 000 mg/L的納米TiO2會損傷大腸桿菌K12 25254和枯草芽胞桿菌39706的細胞膜,有抑菌效果,且抑菌效果隨其質量濃度的增大而增大.Pop等[19]的研究結果也表明納米TiO2的抑菌效果隨其濃度的增大而增大.Karunakaran等[20]的研究顯示,高濃度納米TiO2會抑制土壤中熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和短芽胞桿菌(B.brevis)的生長.孔彬彬等[21]的研究表明,低濃度納米TiO2對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、乳酸桿菌(Lactobacillus)等細菌幾乎沒有抑制作用.本研究還發現,低質量濃度(0.1和1 mg/L)的納米TiO2對部分海洋細菌生長有一定的促進作用,但是,一定時間后,當細菌逐漸適應該質量濃度納米TiO2時,其生長反而會被抑制,因此其生物量會下降.低質量濃度納米TiO2對某些細菌生長有促進作用的原因有待進一步研究.

聚球藻作為海洋中常見光合細菌的代表,葉綠素a含量的變化可反映出細胞代謝活力的變化.因此,選用測定葉綠素a含量作為衡量細胞活性的方法之一.從本研究結果來看,納米TiO2對聚球藻XM-24葉綠素a的含量并未有顯著影響；對聚球藻299,在培養中后期也只有100 mg/L納米TiO2才使葉綠素a含量顯著降低(p<0.05),但在培養中期(6 d),0.1 mg/L納米TiO2對葉綠素a的合成有顯著促進作用(p<0.05).這表明納米TiO2的抑菌作用可能不影響葉綠素a的合成,并且可能因細菌種類而異.陳宇婷等[15]研究表明,低質量濃度納米氧化鐵對聚球藻生長并無抑制作用,對細胞內物質不表現刺激作用.而本研究表明,低質量濃度納米TiO2對聚球藻生長并無抑制作用,甚至還有一定的促進作用.這與非海洋微生物的研究結果一致:成婕等[22]研究表明,低質量濃度(<5 mg/L)納米TiO2可促進斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)生長并促進葉綠素 a的合成,而高質量濃度(>10 mg/L) 則具有抑制作用.納米材料的抑菌機制,可能是由納米材料釋放出活性氧破壞細胞壁和細胞膜所致；或者納米材料直接進入細胞,通過釋放金屬離子,產生氧化脅迫作用,并對DNA產生損害,進而起到抑菌的作用[19].目前國內外對不同納米材料的抑菌機制還沒有定論,有待于進一步深入研究.

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