康復新液對轉化生長因子-β1誘導人胚肺成纖維細胞MRC-5纖維化模型的干預作用

徐秋穎,劉偉偉,王寶家,馬秀英,高永翔*

(1.成都中醫藥大學基礎醫學院,四川 成都 610075;2.藥用美洲大蠊四川省重點實驗室,四川 成都 610000)

肺纖維化(pulmonary fibrosis)發生于許多不同病因引發的肺間質疾病,生理特點表現為肺泡持續性損傷、成纖維細胞(fibroblast)增殖及大量細胞外基質(extracellular matrix,ECM)沉積,從而導致肺組織反復破壞、修復,最終造成肺組織中的大量膠原沉積[1].康復新液是由美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)干燥蟲體的乙醇提取物制成的溶液,其主要成分包括氨基酸(17種以上,包含人體必需氨基酸)、多肽(抗菌肽、咽側體抑制神經肽、焦激肽等)、多糖(硫酸黏多糖等)、核苷(次黃嘌呤、尿嘧啶等)及油脂等[2].《神農本草經》記載其“味咸、寒,生川澤,治血癖癥堅、寒熱,破積聚,喉咽痹,內寒無子”.康復新液可“通利血脈,養陰生肌”,內服可治消化道出血與潰瘍等,外用可療金瘡、外傷等,具有改善黏膜創面微循環、加速機體病損組織修復再生、增強免疫力等功能.已有研究顯示康復新液可以改善實驗性結腸炎,治療小兒手足口病、帶狀皰疹、干癥、頭頸部惡性腫瘤等[3].隨著臨床使用康復新液的范圍不斷擴大,其更多藥效有待挖掘,而目前尚無關于其應用于肺纖維化治療的報道.

在肺纖維化的進程中,許多因子參與調控,其中最重要的是轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1[4-5],它可以促進成纖維細胞的遷移、增殖及其向肌成纖維細胞的轉化,加速ECM的過度分泌,逐漸以纖維組織取代正常的肺組織,對肺功能造成不可逆的破壞.結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是TGF-β1誘導的早期基因表達產物,在病理狀態下,纖維化組織中CTGF的表達量會明顯增加[6].這個過程中肌成纖維細胞會表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)這種獨特的分子[7],而α-SMA增多可明顯增強肌成纖維細胞的遷移及收縮能力,進而增強ECM的合成和分泌.ECM的主要成分是纖維連接蛋白(fibronectin,FN)和層黏連蛋白(laminin,LN),其中FN可以誘導膠原的形成,從而導致臟器的纖維化[8].FN、LN及膠原的合成增多、降解減少會導致ECM的過度積聚,進而導致纖維化.肺纖維化時還會出現基底膜增厚，這主要與FN和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)表達明顯增加有關[9].本研究選取α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、Ⅲ型膠原蛋白(CollagenⅢ)這6種反映肺纖維化程度的因子,作為檢測康復新液對肺纖維化是否有效的客觀指標.通過肺纖維化中的關鍵因子TGF-β1誘導人胚肺成纖維細胞(human fetal lung fibroblast)MRC-5細胞系,構建細胞纖維化模型.驗證此模型成功后,運用CCK-8(cell counting kit-8)法檢測康復新液對MRC-5細胞的毒性,得出康復新液對MRC-5細胞的最高不致死給藥濃度.進而使用此安全濃度干預TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化,從而在細胞層面實現康復新液治療肺纖維化的有效性驗證,旨在擴大中成藥康復新液的適應范圍,從干預肺纖維化的角度對其進行二次開發.

1 材料與方法

1.1 細胞系

MRC-5細胞來源于中國科學院上海細胞庫,使用MEM(minimum essential medium)培養基(Gibco,41500034),添加10%(體積分數)胎牛血清(Gibco,10099-141),于37 ℃、5%(體積分數)二氧化碳的恒溫培養箱中進行培養,5～7 d傳代,按1瓶細胞傳2～3瓶的比例進行.

1.2 試劑及耗材

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測試劑Realtime PCR Master Mix(QPK-201)、反轉錄試劑ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix(FSQ-201)購自ToYoBo公司,RNA抽提試劑TRIzolTMPlus RNA Purification Kit(12183555)購自Invitrogen公司.地塞米松(Dexamethasone,DXM;5 mg/mL,02138)購自西南藥業股份有限公司.LN抗體(ab11575)、FN抗體(ab2413)、α-SMA抗體(ab124964)購自Abcam公司,CTGF抗體(86641)購自CST公司,CollagenⅠ抗體(14695-1-AP)購自Proteintech公司,CollagenⅢ抗體(OM275892)購自Omnimabs公司,內標甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(200306-7E4)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠(511103)與羊抗兔(511203)二抗購自Zen-bioscience公司.無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等均為國產分析純試劑.所用耗材均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，為一次性無RNA酶耗材.

1.3 主要設備和儀器

qRT-PCR儀(CFX96,Bio-Rad公司)、離心機(5415D,Eppendorf公司)、微量分光光度計(NanoDrop 2000,Thermo Fisher公司)、全波長酶標儀(Multiskan Spectrum,Thermo Fisher公司),高速冷凍離心機(Legend Microfuge 22R Centrifuge,Thermo Fisher公司).

1.4 引 物

本研究中所使用的引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成,序列見表1.

表1 引物及其序列

1.5 MRC-5細胞纖維化模型的建立與檢測

MRC-5細胞接種24 h后加入TGF-β1(10 ng/mL)進行誘導[10],分別在0,48與72 h取樣;使用TRIzolTMPlus RNA Purification Kit進行RNA抽提,測定RNA濃度及純度,并用反轉錄試劑ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix按照1 μg/10 μL體系進行逆轉錄;之后以GAPDH為內參,于qRT-PCR儀檢測α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ的mRNA表達水平.20 μL反應體系:SYBR(2×)10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,無核酸酶水6.4 μL.反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性 5 s,60 ℃退火延伸30 s,40個循環.以2-ΔΔCt法進行mRNA相對表達水平的分析.

1.6 CCK-8法檢測

在96孔細胞培養板中按照每孔細胞數104接種,24 h后分別加入10倍、20倍、40倍、80倍、160倍及320倍稀釋的康復新液(使用完全培養基稀釋),同時設置不加藥對照;培養72 h后加入1/10培養基體積的CCK-8試劑,繼續培養1 h,采用酶標儀記錄450 nm的吸光度,繪制生長曲線.

1.7 康復新液干預

*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,下同.圖1 TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型中纖維化指標的mRNA相對表達水平Fig.1 Relative mRNA expression levels of fibrosis indexes in the MRC-5 cell fibrosis model induced by TGF-β1

在6孔細胞培養板中按照每孔細胞數105接種,細胞貼壁后加入10 ng/mL的TGF-β1進行纖維化誘導,24 h后加入最高不致死給藥濃度的康復新液進行干預;在干預24,48與72 h時取樣,用于qRT-PCR與蛋白質免疫印跡(Western blotting,WB)檢測,同時設置DXM(50 μg/mL)陽性對照組,處理72 h后取樣.分別檢測α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ及GAPDH(內參)的表達量.qRT-PCR反應體系與反應程序參照1.5小節步驟.WB操作如下:使用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕洗滌細胞樣品3次,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液,4 ℃裂解20 min,12 000 r/min離心5 min后收取上清;BCA(bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶,濕轉至聚偏氟乙烯膜,5%(質量分數)牛血清白蛋白封閉1 h后加入一抗，4 ℃孵育過夜；含0.5%(體積分數)吐溫-20的Tris-鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次后加入HRP標記二抗,37 ℃孵育1 h后用TBST洗滌3次；加入增強型化學發光底物發光液,于化學發光成像儀下拍照.

1.8 統計學分析

2 結果與分析

2.1 TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型檢測

以10 ng/mL TGF-β1處理MRC-5細胞,通過qRT-PCR分別檢測0,48,72 h后α-SMA、LN、FN、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ這6個特異性纖維化指標的mRNA相對表達水平,結果如圖1所示:FN、CTGF、CollagenⅢ的mRNA相對表達水平在48 h出現顯著升高,α-SMA、LN、CollagenⅠ的mRNA相對表達水平則在72 h出現顯著升高,可見MRC-5細胞在TGF-β1誘導下48 h時出現纖維化,72 h時纖維化充分,呈現出一定的時間依賴性,說明72 h時此模型誘導成功.

2.2 康復新液對MRC-5細胞的毒性檢測

1.空白對照;2.TGF-β1誘導模型;3～5.康復新液干預24，48，72 h;6.DXM陽性對照(下同).圖3 康復新液干預不同時間后TGF-β1誘導MRC-5纖維化細胞模型中纖維化指標的mRNA表達水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of fibrosis indexes after Kangfuxin liquid treatment on the MRC-5 cell fibrosis model for different time

通過CCK-8法檢測不同稀釋倍數的康復新液對MRC-5細胞的毒性,結果見圖2:MRC-5細胞在10～40倍稀釋的康復新液作用下增殖受強烈抑制,在80倍稀釋的康復新液作用下有明顯增殖,160倍及以上稀釋的康復新液作用下與空白對照基本一致.由此可見最高不致死給藥濃度為80倍稀釋,因此后續實驗中使用80倍稀釋作為康復新液的處理濃度.

圖2 CCK-8法檢測康復新液對MRC-5細胞的毒性Fig.2 Toxic effects of Kangfuxin liquid on MRC-5 cells by CCK-8 assay

2.3 康復新液對TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型的干預

以80倍稀釋的康復新液干預TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型,干預時間分別為24,48和72 h,通過qRT-PCR儀檢測6個特異性纖維化指標的mRNA相對表達水平,比較干預不同時間的效果差別,結果如圖3所示:空白對照組和TGF-β1誘導模型組比較有顯著差異；康復新液干預組與TGF-β1誘導模型組比較，干預24 h時mRNA相對表達水平均出現顯著下調;康復新液干預組72 h時與DXM陽性對照組相比,α-SMA和FN的mRNA相對表達無顯著差異,其他纖維化指標的mRNA相對表達水平顯著高于DXM陽性對照組,但也顯著低于TGF-β1誘導模型組.上述結果表明80倍稀釋的康復新液可以有效降低TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型中纖維化指標的mRNA表達水平.

進而通過WB方法檢測康復新液干預不同時間后TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型中上述6個特異性纖維化指標的蛋白表達水平,結果如圖4所示:TGF-β1誘導模型組和空白對照組相比,各蛋白表達水平均上調,說明造模成功;康復新液干預組與TGF-β1誘導模型組相比,α-SMA、CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表達水平在24～72 h持續降低,LN、FN和CTGF蛋白表達水平在48 h出現明顯降低;康復新液干預組與DXM陽性對照組相比,72 h時康復新液干預組中α-SMA、LN、FN和CollagenⅢ蛋白表達水平略高,CTGF和CollagenⅠ蛋白表達水平相當.所得結果與qRT-PCR儀檢測的趨勢基本一致,表明康復新液干預可以有效降低這些纖維化指標的蛋白表達水平.

圖4 康復新液干預不同時間后TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化模型中纖維化指標的蛋白表達水平Fig.4 Relative protein expression levels of fibrosis indexes after Kangfuxin liquid treatment on the MRC-5 cell fibrosis model for different time

3 討 論

在世界范圍內,組織器官纖維化是許多疾病致殘、致死的主要原因.有關統計表明,特發性肺纖維化的患者從疾病診斷到死亡的時間僅2～5年,5年生存率僅20%[11].臨床上這類患者大都會使用糖皮質激素治療,但是糖皮質激素只對1/3的患者有一定的療效,并且長期使用糖皮質激素會出現很多不良反應,如庫欣綜合征、機體免疫力下降、傷口難愈合等[12].雖然2014年美國食品藥品監督管理局(FDA)已批準肺纖維化的藥物吡非尼酮(pirfenidone)和尼達尼布(nintedanib)用于臨床,但這兩種藥物只能延緩疾病進程,對肺纖維化并沒有實質的治療作用,加之進口藥品價格不菲,難以被患者接受,臨床上使用的安全及有效性仍需要更多的數據支持[13].目前國際公認的最有效治療方式是肺移植,但是肺移植存在肺供體少、手術風險大、技術要求高、價格昂貴等缺點,很難在肺纖維化的治療中廣泛選用.因此,拓展新的治療措施并在臨床上推廣有重要的意義.

肺纖維化的形成過程中,成纖維細胞在TGF-β1的刺激作用下被激活并轉化成肌成纖維細胞.而肌成纖維細胞的胞漿豐富,能夠分泌膠原的同時還具有收縮功能,具備成纖維細胞和平滑肌的雙重特性,是造成ECM異常沉積的主要細胞[14].因此肺成纖維細胞不斷增殖并向肌成纖維細胞轉化是肺纖維化發生發展的關鍵所在.

本研究成功構建了TGF-β1誘導的MRC-5細胞纖維化模型,經檢測纖維化特征性因子α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ在建模中的mRNA表達水平均有所上調.以80倍稀釋的康復新液干預此模型后,上述指標因子的mRNA和蛋白表達水平均有所下調,表明康復新液對MRC-5細胞纖維化模型可起到有效的干預作用,效果與DXM相當,為抗纖維化的藥物開發提供了新的思路和方向.但本研究也存在一定的局限性,即本研究中MRC-5細胞來源于中國科學院上海細胞庫,經過多次培養后細胞的增殖及可誘導性都有所下降,因此臨床上康復新液用于肺纖維化患者的效果還有待進一步驗證.

[1] 徐慧蓉,馬小兵,王獻華.肺纖維化相關因子研究進展[J].現代預防醫學,2011,38(10):1953-1955.

[2] 李奇娟,王戰國,劉巧,等.美洲大蠊研究現狀及其研究中關鍵問題分析與展望[J/OL].中國中藥雜志,2018.[2018-02-10].https:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.19540/j.cnki.cjcmm.20180201.009.

[3] 陳新,王洪,張艷萍.康復新液的最新臨床應用[J].中國醫藥指南,2016,6(17):89-96.

[4] THIERY J P,ACLOQUE H,HUANG R Y,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009,139(5):871-890.

[5] RADISKY D C，LEVY D D，LITTLEPAGE L E，et al.Rac1b and reactive oxygen species mediate MMP-3-induced EMT and genomic instability[J].Nature,2005,436(47):123-127.

[6] 劉森炎,錢一欣,卞蓉蓉,等.結締組織生長因子通過上調腎間質成纖維細胞組織型轉谷氨酰胺酶和Ⅲ型膠原蛋白促進腎間質纖維化[J].上海醫學,2017,40(3):173-178.

[7] 滕立霞，于俊生.升降散對系膜增生性腎小球腎炎大鼠腎組織CTGF及α-SMA表達的影響[J].中華中醫藥學刊,2011,29(6):1358-1360.

[8] 陳春宇,陳志強.化瘀通絡中藥對糖尿病腎病大鼠腎組織纖維連接蛋白和層粘連蛋白的影響[J].天然產物研究與開發,2015,27:2134-2137.

[9] 郭治,吳金香.IL-33/ST2激活人肺成纖維細胞表達纖維黏連蛋白Ⅰ和Ⅰ型膠原蛋白參與哮喘氣道重塑[J].細胞與分子免疫學雜志,2014,30(9):975-979.

[10] 朱錦東.牛磺熊去氧膽酸緩解轉化生長因子-β1誘導的MRC-5纖維化表型[D].北京:北京協和醫學院,2015:12-23.

[11] 潘有祿,黃文海,沈正榮.肺纖維化發生機制及治療研究進展[J].中國藥學雜志,2012,47(23):1873-1876.

[12] 周艷.基于“疏通肺絡法”研究艾灸對肺纖維化大鼠上皮細胞-間質細胞轉分化機制的影響[D].成都：成都中醫藥大學,2015:1.

[13] 陳茹萱.中藥紅景天成分對TGF-β1誘導MRC-5細胞纖維化表型的干預 [D].北京:北京協和醫學院,2016:8.

[14] 程飚,付小兵,盛志勇,等.瘢痕組織中α-平滑肌肌動蛋白的表達與細胞凋亡的關系[J].中國病理生理雜志,2002,18(11):1333-1336.