齒毛菌漆酶對活性亮藍的高效脫色

江 聰,尹大強,許鑫琦,林 娟,葉秀云,楊 捷*

(1.福州大學福建省海洋酶工程重點實驗室,福建 福州 350116;2.同濟大學長江水環境教育部重點實驗室,上海 200092)

染料廣泛應用于印染、化妝品、食品等行業,據統計已用于商業的染料種類超過105種,根據其化學結構可分為偶氮類、蒽醌類、靛類、三苯甲烷類和雜環類等[1].目前,我國每年生產的染料高達上百萬噸,其中10%～20%的染料會直接隨廢水排入環境中.染料廢水具有降解難、色度高、染料結構差異大、毒性高等特點,不僅污染環境,而且可能對人和其他生物造成致毒、致癌、致突變的嚴重影響[2].目前染料廢水處理技術主要有物理法、化學法、生物法等.物理法和化學法的效率低、能耗大、成本高且容易形成毒性更強的副產物;與之相比,生物法因具有成本低、效率高且能避免二次污染的優點,被越來越多地應用于染料廢水的處理[3].

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,廣泛分布于高等植物和真菌中,因其催化反應只需要氧氣且最終副產物只有水,被認為是綠色催化劑.漆酶有較廣泛的底物催化范圍,在紡織、造紙、制藥、化妝品、生物修復等領域應用廣泛,其中在紡織和造紙業中被應用于染料廢水的脫色.漆酶的來源是影響其脫色率最重要的因素,例如:Osma等[4]采用絨毛栓菌(Trametespubescens)漆酶對活性亮藍(Remazol Brilliant Blue R,RBBR)染料脫色42 h,脫色率為44%;而Lu等[5]采用血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶對RBBR脫色2 h,脫色率即可達94%.此外,介體和酶的固定化也影響漆酶的脫色效果,小分子介體可以拓寬漆酶的氧化底物范圍,提高脫色率，但在染料脫色處理中存在脫色時間長、脫色率不高的問題，若添加介體會使成本升高,且容易使漆酶失活,還可能具有毒性[6],在一定程度上制約了漆酶的實際應用.因此,篩選高效降解染料的菌種顯得尤為重要.

RBBR是一種蒽醌類染料,由于其著色效果好、色牢度高且可作為前體物質合成許多染料,在紡織和印染工業中應用廣泛,但因其有毒且難降解,被認為是有機污染物的代表[7].本實驗室前期通過選育得到一株齒毛菌(Cerrenaunicolor)菌株HYB07,其具有漆酶產量高、底物范圍廣、催化活力強、穩定性好等優點,最適pH為3.0,常溫下反應能保持較高酶活力[8].本研究利用HYB07菌株制備的漆酶對RBBR進行脫色,以RBBR染料脫色率為響應值,在單因素試驗的基礎上采用響應面法優化脫色條件[9],并通過紅外光譜和薄層色譜分析驗證RBBR的降解效果,以期為漆酶在染料脫色中的應用提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 主要材料

齒毛菌HYB07菌株由福建省海洋酶工程重點實驗室篩選保存.馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基按照《微生物學實驗》中的方法[10]配制.種子培養基配方與PDA固體培養基相同,但不添加瓊脂.液體產酶培養基(1 L):糊精60 g，蛋白胨15 g，酒石酸銨2 g，KH2PO46.0 g，MgSO4·7H2O 4.2 g，CaCl20.3 g，NaCl 0.2 g，CuSO4·5H2O 62.5 mg，ZnSO4·7H2O 18.0 mg，維生素B115.0 mg.

RBBR和2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)購于美國Sigma公司,乙腈(色譜純)、無水乙酸鈉、冰乙酸、糊精、蛋白胨、瓊脂等(均為分析純)試劑購買于國藥化學試劑有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 漆酶的制備

取斜面保藏的齒毛菌HYB07菌株接種于PDA平板,30 ℃恒溫培養3～4 d.菌株活化后,接種于液體種子培養基,30 ℃恒溫搖瓶培養2 d,制成一級種子液;然后將一級種子液以6%(體積分數,下同)的接種量接入二級種子培養基中,30 ℃恒溫搖瓶培養2 d;再將二級種子液以6%的接種量接入液體產酶培養基中,30 ℃恒溫搖瓶發酵6 d.12 000 r/min室溫離心分離菌絲體和發酵液,上清液即為粗酶液,置于4 ℃冰箱保存備用.

1.2.2 漆酶活力及蛋白質含量測定

漆酶活力測定[5]以ABTS為底物,反應體系2.0 mL,其中含0.975 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 3.0)、1.0 mL 0.5 mol/L ABTS溶液和25 μL粗酶液.30 ℃恒溫水浴反應,測定前5 min內ABTS在420 nm(ε420=36 000 L/(mol·cm))處吸光度的增加值.以熱滅活10 min的粗酶液作為空白對照.每分鐘催化氧化1 μmol ABTS所需的酶量定義為1個酶活力單位(U).蛋白含量測定采用Bradford法,并繪制牛血清白蛋白標準曲線[8],測得漆酶比活力為629.8 U/mg.實驗均設置3組平行樣品,并進行均方差分析.

1.2.3 染料脫色率的測定

采用全波長酶標儀(Multiskan GO,Thermo Scientific公司)在波長200～1 000 nm范圍內對RBBR溶液進行全波長掃描,確定最大吸收波長為574 nm,并測定脫色前后574 nm處的吸光度A0和A1,計算脫色率R(%):R=(1-A1/A0)×100%.

1.2.4 響應面法優化漆酶對RBBR脫色的條件

利用單因素試驗分別對pH(3.0～7.0)、酶濃度(0.1～5 U/mL)、染料質量濃度(50～800 mg/L)、脫色時間(10～60 min)進行優化.緩沖液采用甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 3.0)和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.0～7.0).基于單因素試驗優化的結果,采用Design Expert v8.0.6軟件的中心組合設計(central composite design,CCD)建立4因素3水平的響應面法分析模型,確定漆酶對RBBR脫色的最佳條件.以脫色率為響應值,酶濃度、染料質量濃度、pH和脫色時間為自變量,每個自變量均選擇3個水平:酶濃度選擇0.8,1.5,2.2 U/mL;染料質量濃度選擇100,150,200 mg/L;pH選擇4.0,5.0,6.0;脫色時間選擇20,30,40 min.

1.2.5 漆酶對RBBR反應的動力學參數測定

配制不同質量濃度(20～2 000 mg/L)的RBBR染料,以pH 4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液,酶濃度為1 U/mL,脫色10 min后測定脫色率;利用GraphPad Prism v5.0軟件進行非線性回歸分析,計算漆酶反應的米氏常數Km和最大速率Vm.實驗進行3次重復.

1.2.6 紅外光譜分析

將在最佳條件下脫色的RBBR混合液樣品和加入滅活漆酶處理的RBBR樣品進行冷凍干燥,取2 mg冷凍干燥后的固體,加入200 mg KBr，混勻,在瑪瑙研缽中研磨、壓片;用傅里葉紅外光譜儀(360智能型,美國尼高麗儀器有限公司)先對純KBr薄片進行背景掃描,再對樣品的薄片進行掃描,得到紅外光譜圖;比較紅外光譜圖，分析RBBR經漆酶催化脫色后的化學鍵斷裂情況.

1.2.7 薄層色譜分析

在硅膠薄層層析點樣板上,將在最佳條件下脫色的RBBR混合液樣品和加入滅活漆酶處理的RBBR樣品進行上樣;在擴展槽內加入適量展樣劑,放入硅膠點樣板,加蓋密封展樣,展樣劑為V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=3∶1∶1;當樣品完全展開后,取出晾干,放入裝有碘晶體的密閉容器中顯影,以判斷RBBR脫色處理后是否產生了新物質.

2 結果與討論

2.1 基于響應面法的脫色條件優化

通過單因素優化試驗(圖1),得到齒毛菌HYB07菌株所產漆酶對RBBR脫色的最佳條件為:pH 5.0,酶濃度3 U/mL,染料質量濃度100 mg/L,脫色時間30 min.溫度對酶的催化活性也有較大影響,但前期研究中發現該漆酶在室溫下可保持較高的催化活性,故本研究中未對溫度進行優化.

圖1 單因素優化試驗Fig.1 Single factor optimization test

在單因素優化試驗基礎上,采用Design Expert v8.0.6軟件用-1,0,1對酶濃度(X1)、染料質量濃度(X2)、pH(X3)和脫色時間(X4)這4個因素編碼,脫色率(Y)為響應值.通過CCD對4個因素進行優化,再對試驗結果進行多元回歸擬合,得到脫色率的回歸模型方程為:

Y=86.10+12.90X1-2.54X2-13.49X3+

7.40X4+0.63X1X2+0.83X1X3+

1.46X1X4+3.81X2X3+1.16X2X4+

1.26X3X4-6.34X12-2.63X22-

14.13X32-4.66X32.

回歸模型方程的方差分析結果見表1.回歸模型的F值為41.04,p<0.000 1,表明所得模型差異極顯著;模型誤差失擬p=0.143 8>0.05,說明該模型失擬不顯著,即該二次方程能夠較好地擬合真實水平,可靠性較高;模型的一次項中X1、X3、X4差異極顯著,X2X3交互項差異顯著,二次項中X12、X32、X42差異極顯著,X22差異顯著.模型的決定系數和校正決定系數分別為95.81%和92.04%,說明該模型精確性較高.因此,該模型可用于RBBR脫色率的預測.

各因素的F值可以用來評價該因素對試驗指標影響的顯著程度，F值越大表示該因素的影響越顯著.如表1所示,F(X1)=140.82,F(X2)=5.48,F(X3)=154.16,F(X4)=46.35,由此綜合分析可知,在所選取的因素水平范圍內,各因素對脫色率的影響由大到小依次為:pH>酶濃度>脫色時間>染料質量濃度.

根據二次回歸方程繪制響應面圖和等高線圖,可得到最佳參數及各參數間的相互作用.響應面曲線可用于解釋變量間的交互作用并確定達到最高脫色率時每個變量的最優水平.響應面曲面的坡度可反映該因素對RBBR脫色率影響的強弱程度.每個響應面表示當其中1個變量處于最佳水平時,另外2個獨立變量之間的相互作用.等高線圖中同一橢圓曲線上染料的脫色率是相同的,染料脫色率在橢圓形的中心值最高,并由中心向邊緣逐漸降低.同時等高線的形狀可反映交互效應的強弱,橢圓形表示2個因素交互作用明顯,圓形表示交互作用不明顯.本研究選定4個主要因素,優化可以得到4個因素兩兩之間交互的6個響應面圖(圖2)和相應的等高線圖(圖3).

表1 回歸模型方程的方差分析

注：*p<0.05,差異顯著;**p<0.001,差異極顯著.

圖3 不同因素交互作用對RBBR脫色率影響的等高線圖Fig.3 Contour line plots of the interactive effect of different factors on RBBR decolorization

圖2(a)和(b)所示的兩因素交互作用最小,在選定的pH和染料質量濃度范圍內,RBBR脫色率呈現先升高后降低的趨勢,存在極大值;而RBBR脫色率隨酶濃度的增加而增大.同時由對應的等高線圖(圖3(a)和(b))可見,pH對應的等高線變化趨勢較染料質量濃度的陡峭,因此推測pH對RBBR脫色率的影響比染料質量濃度大.圖3(a)顯示酶濃度與染料質量濃度的等高線近似于圓形,表明酶濃度與染料質量濃度的交互效應不明顯;而由圖3(d)可以看出,染料質量濃度與pH的等高線呈橢圓形,且中心點角度大,表明兩因素的交互效應明顯.

2.2 RBBR最佳脫色條件及檢驗

分析得到最大響應值時,X1～X4對應的編碼值分別為1.055,0.523,-0.480,0.830,與其相對應的理論預測最佳脫色條件為:酶濃度2.24 U/mL,染料質量濃度123.83 mg/L,pH 4.52,脫色時間38.30 min,預測最佳脫色率可達99.82%.為檢驗響應面法的可靠性,采用上述最佳脫色條件進行實驗,并考慮到實際操作條件的簡化,將最佳脫色條件修正為:酶濃度2.2 U/mL,染料質量濃度124 mg/L,pH 4.5,脫色時間38 min.在此條件下進行3次實驗,得到脫色率為(98.42±1.39)%,與理論預測值差異不顯著,說明用響應面法優化漆酶對RBBR脫色的條件具有可行性.

目前在國內外報道的漆酶對RBBR脫色降解的研究中,降解體系大致分為酶、酶-介體(laccase-mediator system,LMS)和固定化酶3種.在LMS的處理中,Sathishkumar等[11]應用Pleulrotusflorida漆酶對RBBR脫色,添加介體1-羥基苯并三唑(HBT)處理的脫色率是純酶處理的1.56倍;類似地,Soares等[12]研究表明,商業漆酶CLF只有添加介體才能對RBBR脫色.在不添加介體的報道中,Mechichi等[13]研究顯示添加0.1 mmol/L HBT并不能提高毛栓菌(T.trogii)漆酶對RBBR的脫色率;Khlifi等[14]認為變色栓菌(T.versicolor)漆酶可以單獨對RBBR進行脫色而不需要介體.在固定化酶處理中,Kunamneni等[15]采用嗜熱絲孢桿菌(Myceliophthomthermo-phila)漆酶,在固定化和添加HBT的情況下,對RBBR脫色24 h的脫色率為31%.表2總結了目前已報道的不同菌種所產漆酶對RBBR的降解特性,綜合比較表中數據可知:雖然介體的添加和酶的固定化處理對脫色時間和脫色率有一定影響,但菌種來源是影響漆酶對染料脫色的最重要因素,因此篩選一株高效脫色的產漆酶菌種尤為重要.本研究采用的齒毛菌HYB07菌株所產漆酶對RBBR的脫色時間為38 min,脫色率達(98.42±1.39)%,比目前已有報道的漆酶脫色效果更佳.

表2 不同菌種所產漆酶對RBBR的降解特性

注：*酶活測定底物為2,6-二甲氧基酚,此外其他酶活測定底物均為ABTS.VA為紫脲酸,ACE為乙酰丁香酮.

2.3 漆酶對RBBR脫色反應的動力學分析

如圖4所示,在RBBR質量濃度0～200 mg/L范圍內,脫色反應速率呈線性上升,隨著RBBR質量濃度的增加,反應速率增加逐漸趨于平緩.這種變化趨勢符合米氏方程描述的反應速率隨底物濃度的變化規律.

圖4 漆酶對RBBR脫色的反應動力學Fig.4 The kinetics of RBBR decolorization reaction by laccase

通過GraphPad Prism v5.0軟件求得漆酶對RBBR脫色反應的Km值為(134.82±3.05) mg/L,Vm值為(9.68±0.85) mg/(L·min);反應動力學方程為Y=9.68X/(134.82+X),其中X為RBBR質量濃度,Y為反應速率.Km是酶催化反應的特征常數之一,反映酶對底物親和力的大小.P.florida漆酶對RBBR脫色反應的Km值為145.82 mg/L[7],高于本研究的結果,但需要添加介體才能達到較高的脫色率,而本研究采用的齒毛菌漆酶不需要添加介體也能達到98%以上的脫色率,進一步證明了該漆酶運用于RBBR染料脫色的實際價值.

2.4 RBBR降解產物分析

圖5為RBBR染料脫色前后的紫外-可見光譜譜圖.由圖可見,脫色前RBBR在可見光區595 nm處有一個明顯的特征吸收峰，而在加入漆酶脫色處理后此處的吸收峰消失,證明染料RBBR發生了降解.類似地,戴文魁[22]曾報道的雜色云芝菌(CoriolusversicolorLZ-8)漆酶降解RBBR的實驗結果顯示,在脫色處理后400～700 nm范圍內的特征吸收峰消失.

圖5 RBBR脫色前后的紫外-可見光譜Fig.5 UV-visible spectra of RBBR before and after decolorization

利用紅外光譜分析波數4 000～500 cm-1范圍內RBBR脫色前后的產物,由譜圖可見脫色后955.35和1 266.78 cm-1處的吸收峰消失(圖6).該峰是C—N的伸縮振動峰,說明RBBR經漆酶處理后結構發生變化,C—N鍵斷裂造成發色基團被破壞,使RBBR從藍色變成無色.Osma等[4]采用絨毛栓菌漆酶對RBBR處理后也發現C—N鍵斷裂,發色基團被破壞,并形成兩個副產物,與本研究結果一致.

圖6 漆酶對RBBR脫色前后的紅外光譜Fig.6 The infrared spectra of RBBR before and after decolorization with laccase

通過薄層色譜進一步驗證RBBR經漆酶處理后的結構變化,結果顯示脫色后產生一個新的條帶(圖7),證明其結構確實發生了改變.

圖7 漆酶對RBBR脫色前后的薄層色譜圖Fig.7 The thin layer chromatography of RBBR before and after decolorization with laccase

3 結 論

本研究在單因素試驗基礎上,通過響應面法建立了齒毛菌漆酶對RBBR脫色條件的二次項數學模型,得出影響脫色效果的因素主次順序為pH>酶濃度>脫色時間>染料質量濃度,并得到最佳脫色條件為:酶濃度2.24 U/mL,RBBR染料質量濃度123.83 mg/L,pH 4.52,脫色時間38.30 min.在此條件下,進行3次驗證實驗,測得脫色率為(98.42±1.39)%.通過紅外光譜和薄層色譜分析,發現RBBR經齒毛菌漆酶處理后C—N鍵發生斷裂,RBBR結構發生變化.以RBBR為底物,齒毛菌漆酶催化脫色反應的Km值為(134.82 ±3.05) mg/L.本研究采用的白腐真菌齒毛菌漆酶在未添加介體的情況下,脫色效果明顯高于已有文獻報道的結果,在染料降解方面具有較大的應用潛力.

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