飛行時間質譜系統微生物樣本處理試劑與Bruker樣本處理基質預處理對病原菌鑒定效能的影響研究

馬慶偉，周鳳麗，戰曉微，王莉莉，劉昕超，曲芬，曹峰林

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix－assisted Laser Desorption－ionization Time－of－flight Mass Spectrometry，MS）技術是近年來發展起來的鑒定病原微生物的新技術，可通過對供試病原微生物蛋白指紋圖譜進行同源分析而快速鑒定菌種，對疾病診斷具有重要意義［1-4］。與傳統病原微生物鑒定方法相比，MS技術具有靈敏度較高、準確率較高、耗能較低、高通量等優點。目前，臨床微生物實驗室使用的MS系統多為德國布魯克基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Bruker Microflex MS）系統和法國梅里埃公司的Vitek質譜系統，但進口質譜儀價格昂貴，一次性投入成本較高。國產Clin－TOF－Ⅱ型MS系統及其配套的飛行時間質譜系統微生物樣本處理試劑（Clin－TOF試劑）在價格和臨床鑒定準確率方面均具有優勢。本研究旨在比較Clin－TOF試劑與Bruker樣本處理基質液（Bruker基質液）預處理對病原菌鑒定效能的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取2017年1—5月中國人民解放軍第302醫院臨床常規分離的菌株103株，其中革蘭陰性菌36株、革蘭陽性菌33株、真菌34株，均置于－80 ℃冰箱中保存待測。

1.2 試劑與儀器 Clin－TOF－Ⅱ型MS系統及其配套Clin－TOF試劑購自北京毅新博創生物科技有限公司，Bruker Microflex MS系統購自德國布魯克?道爾頓公司，Bruker基質液根據Bruker配方配制。

1.3 方法

1.3.1 菌株傳代 將常規分離的103株菌株置于固體培養基上進行三區劃線，用接種環挑取單菌落。

1.3.2 儀器校正 檢測前使用大腸桿菌ATCC8739單菌落（購自中國工業微生物菌種保藏管理中心）為標準品進行儀器校正，嚴格按照儀器使用說明書進行操作。

1.3.3 Clin－TOF試劑預處理供試菌株 每個離心管（200 μl）中加入30 μl組分Ⅰ，采用無菌接種環或槍頭挑取單菌落放于離心管中，震蕩混勻5 min，加1 μl樣品到靶板上，自然干燥后加1 μl組分Ⅱ，覆蓋在樣品點上，自然干燥后分別使用Clin－TOF－Ⅱ型MS系統和Bruker Microflex MS系統采集圖譜并進行鑒定，每個菌株平行檢測3次。

1.3.4 Bruker基質液預處理供試菌株 無菌牙簽挑取樣品單菌落均勻抹在Macro 96孔靶板上，自然干燥后在樣品點上覆蓋1 μl Bruker基質液，自然干燥后分別使用Clin－TOF－Ⅱ型MS系統和Bruker Microflex MS系統采集圖譜并進行鑒定，每個菌株平行檢測3次。

1.4 結果判定 Clin－TOF－Ⅱ型MS系統：置信度≥25.0分為鑒定結果可信；置信度為20.0～24.9分需通過其他實驗進行驗證，選出最終鑒定結果；置信度＜20.0分為鑒定結果不可靠，建議重新處理菌株或重新采集樣品點測試。Bruker Microflex MS系統鑒定分值2.300～3.000為鑒定在種水平完全可靠；分值2.000～2.299為鑒定在屬水平可信；分值1.700～1.999為鑒定在屬水平有可能。所有菌株經16S rRNA擴增測序進行驗證。

1.5 統計學方法 應用SPSS 10.0統計軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株情況 革蘭陰性菌36株，其中產酸克雷伯菌5株、肺炎克雷伯菌3株、摩氏摩根菌3株、黏質沙雷菌3株、陰溝腸桿菌3株、鮑曼不動桿菌2株、銅綠假單胞菌2株、液化沙雷菌2株、嗜麥芽窄食單胞菌2株、副溶血弧菌2株、流感嗜血桿菌2株、皮特不動桿菌1株、弗勞地檸檬酸桿菌1株、大腸埃希菌1株、產氣腸桿菌1株、奇異變形菌1株、施氏假單胞菌1株、腐敗希瓦菌1株。革蘭陽性菌33株，其中紋帶棒桿菌2株、鳥腸球菌1株、鉛黃腸球菌1株、小腸腸球菌1株、糞腸球菌2株、屎腸球菌1株、單核增生李斯特菌2株、藤黃微球菌2株、空間羅菌1株、無乳鏈球菌2株、表皮葡萄球菌2株、溶血葡萄球菌2株、人葡萄球菌1株、金黃色葡萄球菌2株、停乳鏈球菌2株、路鄧葡萄球菌2株、腐生葡萄球菌1株、沃氏葡萄球菌2株、解沒食子酸鏈球菌1株、口腔鏈球菌2株、唾液鏈球菌1株。真菌34株，其中白色假絲酵母菌2株、鏈狀假絲酵母菌3株、光滑假絲酵母菌2株、希木龍假絲酵母菌3株、平常假絲酵母菌3株、葡萄牙假絲酵母菌3株、Candida nivariensis 3株、近平滑假絲酵母菌3株、熱帶假絲酵母菌1株、羅倫隱球菌3株、新型隱球菌1株、東方伊薩酵母1株、奧默柯達菌1株、異常畢赤酵母1株、費比恩畢赤酵母1株、季也蒙畢赤酵母1株、膠紅酵母菌1株、阿薩希絲孢酵母菌1株。

2.2 質譜圖 在Clin－TOF－Ⅱ型MS系統上，采用Clin－TOF試劑預處理供試菌株后所得質譜圖基線平滑，特征信號較多，信噪比較高，重現性較好；對較難鑒定的新型隱球菌也能檢測出特征信號。使用Bruker基質液預處理供試菌株后，所得質譜圖特征信號較少，信噪比較低，多次點樣后質譜圖重現性較差，見圖1。

但哥們兒朝洛蒙想錯了。搬家那天就被冰箱砸著了腳趾頭，腫得像個白蘿卜。到診所點了藥水，纏了些繃帶，耽誤了半天工，上班時一只腳上還穿著塑料拖鞋，走路一瘸一拐的像裝著假肢。

2.3 菌株鑒定結果 在Clin－TOF－Ⅱ型MS系統上，Clin－TOF試劑預處理和Bruker基質液預處理后革蘭陰性菌單次鑒定準確率、3次平行鑒定準確率及真菌3次平行鑒定準確率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Clin－TOF試劑預處理后革蘭陽性菌單次鑒定準確率、3次平行鑒定準確率及真菌單次鑒定準確率高于Bruker基質液預處理，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。在Bruker Microflex MS系統上，Clin－TOF試劑預處理和Bruker基質液預處理后革蘭陰性菌單次鑒定準確率、3次平行鑒定準確率，革蘭陽性菌單次鑒定準確率、3次平行鑒定準確率，真菌單次鑒定準確率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Clin－TOF試劑預處理后真菌3次平行鑒定準確率高于Bruker基質液預處理，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

3 討論

質譜圖的穩定性和重現性是微生物獲得準確鑒定結果的重要影響因素。微生物蛋白指紋圖譜的峰型分布受多種因素影響，如培養基、培養時間、處理方法、基質配方等［5-6］。既往研究結果顯示，不同基質配方會影響質譜儀出峰情況［7］，分析其原因可能與細菌和真菌細胞壁的主要成分及不同菌種細胞壁厚度不同有關。細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖，革蘭陽性菌的細胞壁厚度為20～80 nm，革蘭陰性菌的細胞壁厚度為10～15 nm；真菌細胞壁的主要成分為幾丁質和葡聚糖，厚度為100～250 nm［8］。因此，選擇合適的基質配方是成功使用MS技術的關鍵。基質的主要作用是吸收能量傳遞給樣品分子，并保護樣品分子不被強烈的激光破壞，減弱樣品分子間的相互作用。目前，MS常用的基質配方包括α－氰基－4－羥基肉桂酸（CHCA）、2，5－二羥基苯甲酸（DHB）、蒽三酚（DI）、阿魏酸（FA）、3－吲哚丙烯酸（IAA）、維A酸（RA）、2，4，6－ 三羥基苯乙酮（THAP）等［9］。Clin－TOF試劑是根據細菌和真菌細胞壁的特點對預處理基質配方進行優化，利于細胞破壁，降低了人為配置預處理試劑導致的誤差，提高了質譜圖的穩定性及微生物鑒定準確率。本研究使用的Clin－TOF試劑包括組分Ⅰ和組分Ⅱ，經Clin－TOF試劑預處理后微生物蛋白指紋圖譜特征峰更多，基線平滑，信噪比較高，有助于獲得更穩定的鑒定結果。

圖1 Clin－TOF試劑和Bruker基質液預處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統質譜圖Figure 1 Mass spectrogram of Clin－TOF－Ⅱ type MS after pre－processing of Clin－TOF Reagent and Bruker Matrix

表1 不同預處理試劑預處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統鑒定結果比較（±s，%）Table 1 Comparison of identification results on Clin－TOF－ Ⅱ type MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

表1 不同預處理試劑預處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統鑒定結果比較（±s，%）Table 1 Comparison of identification results on Clin－TOF－ Ⅱ type MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

預處理試劑　　革蘭陰性菌　　革蘭陽性菌　　真菌單次鑒定準確率　3次平行鑒定準確率　　單次鑒定準確率　3次平行鑒定準確率　　單次鑒定準確率　3次平行鑒定準確率Clin－TOF 試劑　100.00±0.00　92.59±3.00　100.00±0.00　97.98±2.02　100.00±0.00　98.04±1.96 Bruker基質液　100.00±0.00　96.30±2.21　87.88±5.31　82.83±5.55　64.71±8.32　58.82±8.09 t值　0.000　　－1.021　2.101　2.392　4.243　4.710 P值　1.000　0.311　0.044　0.022　　＜0.001　3.468

表2 不同預處理試劑處理供試菌株后Bruker Microflex MS系統鑒定結果比較（±s，%）Table 2 Comparison of identification results on Bruker Microflex MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

表2 不同預處理試劑處理供試菌株后Bruker Microflex MS系統鑒定結果比較（±s，%）Table 2 Comparison of identification results on Bruker Microflex MS between pre－processing of Clin－TOF Reagent and pre－processing of Bruker Matrix

預處理試劑　　革蘭陰性菌　　革蘭陽性菌　　真菌單次鑒定準確率　3次平行鑒定準確率　　單次鑒定準確率　3次平行鑒定準確率　　單次鑒定準確率 3次平行鑒定準確率Clin－TOF 試劑　100.00±0.00　92.59±2.69　100.00±0.00　97.98±2.02　85.29±6.16　83.33±6.33 Bruker基質液　100.00±0.00　94.44±2.48　93.94±4.35　91.92±4.36　70.59±7.93　60.78±7.89 t值　0.000　　－0.505　1.437　1.261　1.464　2.228 P值　1.000　0.615　0.160　0.214　0.148　0.029

本研究比較了Clin－TOF試劑與Bruker基質預處理對病原菌鑒定效能的影響，結果顯示，在Clin－TOF－Ⅱ型MS系統上，Clin－TOF試劑預處理后革蘭陽性菌單次鑒定準確率、3次平行鑒定準確率及真菌單次鑒定準確率高于Bruker基質液預處理；在Bruker Microflex MS系統上，Clin－TOF試劑預處理后真菌3次平行鑒定準確率高于Bruker基質液預處理；提示與Bruker基質液相比，采用Clin－TOF試劑預處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統對革蘭陽性菌及真菌鑒定準確率較高，Bruker Microflex MS系統對真菌鑒定準確率較高，分析其原因可能與Clin－TOF試劑有助于菌體蛋白成分釋放有關。

綜上所述，與Bruker基質液相比，采用Clin－TOF試劑預處理供試菌株后Clin－TOF－Ⅱ型MS系統對革蘭陽性菌及真菌鑒定準確率較高，Bruker Microflex MS系統對真菌鑒定準確率較高。此外，采用Clin－TOF－Ⅱ型MS系統及其配套Clin－TOF試劑具有準確、靈敏、快速、高通量等優點，解決了臨床微生物鑒定工作成本高、周期長、重復性差等問題，對微生物鑒定工作具有重要意義。