黃連素對肝癌細胞系HepG2細胞體外遷移影響及其機制研究*

陳建衛，高 娟，朱忠輝，宮衛東，衛飛鵬，劉曉宇，李曉冰

空軍軍醫大學唐都醫院介入放射科(西安 710038)

肝癌(Hepatocellular carcinoma)是我國最為常見的惡性腫瘤之一，具有易復發、易轉移和預后差的特點，其發病率和致死率在我國居高不下[1]。我國每年約有40萬人被確診為肝癌。目前肝癌的治療方式仍以手術切除為主，但對于無法切除的肝癌則只能選擇放化療，副作用巨大，給患者帶來極大的精神負擔，高效經濟的肝癌治療和預后藥物一直是市場空白。除此之外，肝癌復發和轉移是大多數患者在手術后面臨的重要難題。因此，研究肝癌高復發率和高轉移率的具體機制就顯得尤為重要。

黃連素是臨床上一種較為常見的天然生物堿藥物，具有解熱、抗炎[2]和抗腫瘤活性[3]，且少有藥物副作用。與化學合成藥物相比，黃連素作為天然生物堿藥物，展現出眾多優勢。現代藥理學研究表明，黃連素對動物乳腺癌[4]、肺癌[5]、腹水瘤[6]等惡性癌癥具有明顯的治療作用。同時，黃連素對肝癌細胞的細胞周期也表現出顯著的阻滯作用[7]。此外，黃連素臨床數據表明，其還有抗心律失常等作用。細胞實驗結果表明，黃連素有較強的體外抗腫瘤活性[8]，并且能誘導B16細胞分化，具有良好的生物活性，因此進一步探討黃連素對肝癌細胞抑制作用的潛在機制對臨床治療有著重要指導意義。

有研究表明，癌癥組織相比癌旁組織有著更低的自噬水平[9]，癌癥組織自噬水平的異常表達與其異常的細胞周期密切相關。大部分癌癥細胞的細胞周期相比正常細胞更短，因此癌細胞能夠迅速增殖。因此癌癥細胞內環境穩態維護就尤為重要，破壞癌細胞的異常細胞周期也是常見的癌癥治療方式，如癌癥的化學藥物治療。自噬是細胞維持自身內環境穩態的重要手段，同時也是細胞死亡的重要方式之一[10]。抗癌藥物大多會影響腫瘤細胞自噬水平，而自噬是否參與黃連素對肝癌細胞的抑制作用依然少有報道。細胞自噬本身是個復雜的過程，細胞發生應激時，自噬能夠防止有毒或致癌的損傷蛋白質和細胞器積累，抑制細胞癌變；然而癌癥一旦發生，自噬為癌細胞提供營養，促進癌癥發展。因此自噬在癌癥發生發展過程中是一把有趣的雙刃劍[11]。對于基礎代謝異常的肝癌細胞而言，自噬極有可能發揮更為復雜的作用。本研究以人肝癌細胞系HepG2細胞為研究對象，闡述黃連素通過自噬抑制肝癌細胞體外遷移，為肝癌臨床治療提供新的方向。

材料與方法

1 材 料

1.1 人肝癌細胞系HepG2購自中科院上海生命科學院細胞資源中心。

1.2 DMEM高糖培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(四季青公司)；青鏈霉素混合液、胰酶(Gibco公司)；黃連素(上海信誼公司)；3-MA(Sigma公司)；ECL發光試劑盒、RIPA中強細胞裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、MTT試劑盒(碧云天生物公司)；LC3B抗體、β-actin抗體(Proteintech公司)； 辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(中杉金橋生物公司)；GFP慢病毒、Polybrene(漢恒生物公司)；PVDF膜(Millipore公司)；24孔細胞培養板、96孔細胞培養板(Corning公司)；甲醇、二甲基亞砜(四川科隆)。

2 方 法

2.1 MTT細胞活力檢測:于細胞培養瓶中胰酶消化HepG2細胞后，以同體積10%胎牛血清培養基終止消化，細胞懸液轉移至離心管中，1200 rpm離心后棄上清。2 ml培養基重懸HepG2細胞，細胞計數，稀釋細胞懸液。以每孔2×104個細胞數接種至96孔細胞培養板中。HepG2細胞接種24 h后，更換10%胎牛血清培養基，并進行不同濃度黃連素處理24 h。96孔細胞培養板每孔加入MTT溶液20 μl，37 ℃孵育至紫色結晶生成，吸去細胞培養板中的上層培養基，避免觸碰底部紫色結晶，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，96孔細胞培養板置于搖床上輕輕震蕩溶解板底紫色結晶。酶標儀檢測各孔在490 nm波長吸光度。

2.2 蛋白質印記法檢測蛋白相對表達水平: RIPA裂解液加入細胞樣品中，冰上靜置30 min后，樣品收集轉移至1.5 ml EP管中，4 ℃ 12000 r/min 離心30 min，吸取上層清液，轉移至新1.5 ml EP管中。樣品采用BCA蛋白測定試劑盒進行蛋白定量。以每個樣品20 μg蛋白量上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳恒壓80 V分離蛋白，PVDF膜60 V恒壓轉印2 h。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h后，4 ℃封入塑封膜中孵育一抗(LC3B 1∶1000；β-actin 1∶3000)過夜。TBST清洗PVDF膜3遍后，于室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000) 1 h。TBST清洗PVDF膜6遍后，置于塑封膜上，加入適當的ECL發光液后，轉移入化學發光凝膠成像系統曝光。圖像使用Image J軟件進行分析，將目的蛋白條帶灰度值轉為OD值，并與β-actin跳大進行比較，以相對值代表蛋白相對表達量。

2.3 細胞劃痕遷移實驗: HepG2細胞以每孔1×105個細胞接種于24孔板中，約24 h后觀察細胞生長情況。待細胞均勻貼壁24孔細胞培養板80%面積后，使用移液槍頭在24孔細胞培養板底部劃上“十”字，吸出原有培養基，使用PBS清洗漂浮的細胞3遍。在24孔細胞培養板中重新加入10%胎牛血清培養基，并進行黃連素和3-MA藥物干預。分別于藥物處理0h和24 h，在熒光顯微鏡下拍照記錄細胞位置，觀察細胞遷移情況并使用Image J軟件進行遷移距離測量。

2.4 細胞慢病毒轉染：胰酶消化貼壁的HepG2細胞，10%胎牛血清培養基終止消化后轉移至離心管中，1200 rpm離心后棄上清。離心管中加入2 ml培養基重懸HepG2細胞，細胞計數，稀釋細胞懸液，每孔細胞數控制在4×104至6×104個細胞。將HepG2細胞重懸于0.5 ml無血清DMEM培養基中，加入0.5 μg polybrene和GFP慢病毒，輕輕混勻，避免氣泡產生，病毒感染MOI值為5。將含有慢病毒的細胞懸液轉移至24孔細胞培養板中，每孔500 μl細胞懸液，培養48 h后，更換10%胎牛血清培養基。加入嘌呤霉素純化感染的細胞3～5 d，顯微鏡下觀察95%以上細胞攜帶綠色熒光后，進行HepG2 GFP細胞傳代、保種凍存以及細胞劃痕遷移實驗。

3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，數值均采用均數±標準差表示，兩組間采用t檢驗進行顯著性分析，多組間采用ANOVA進行顯著性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度黃連素對Hepg2細胞存活的影響 為確認黃連素對HepG2細胞存活的影響，我們選擇10μmol/L、25μmol/L和50μmol/L濃度的黃連素處理HepG2細胞24 h。MTT實驗結果顯示，與溶劑對照組相比，25μmol/L和50μmol/L的黃連素能夠顯著降低HepG2細胞的存活；但10μmol/L黃連素處理組并未發現細胞活力顯著降低(圖1)。實驗結果證實，黃連素對HepG2細胞具有細胞毒性作用，且存在劑量依賴性，但低劑量黃連素并未表現出明顯的細胞毒性作用。

2 黃連素抑制HepG2細胞體外遷移 考慮到黃連素對HepG2細胞的殺傷作用，為避免HepG2細胞過量死亡對遷移的影響，我們選擇低劑量10μmol/L黃連素，觀察其對HepG2細胞體外遷移的作用。使用黃連素處理HepG2 GFP熒光細胞，并在0 h和24 h拍照記錄其細胞位置。細胞劃痕遷移實驗結果表明，10μmol/L黃連素顯著抑制HepG2細胞的體外遷移(圖2)。

3 自噬參與黃連素對HepG2細胞體外遷移的調控 使用10μmol/L黃連素處理HepG2細胞，LC3B-Ⅱ蛋白表達水平隨時間依賴性變化，且在24 h達到峰值(圖3 A)。黃連素作用于HepG2細胞后，出現抑制遷移和促進自噬的作用，考慮兩者是否存在調控作用。為證明HepG2細胞自噬和遷移的關系，我們使用自噬抑制劑3-MA干預，觀察其對黃連素抑制HepG2細胞遷移的影響。實驗結果表明，3-MA能夠逆轉10 μmol/L黃連素對HepG2細胞體外遷移作用(圖3 B)。以上結果提示，黃連素通過HepG2細胞自噬，調控其體外遷移。

圖1 不同濃度的黃連素對HepG2細胞活力的影響

圖2 黃連素抑制HepG2細胞體外遷移

圖3 自噬參與黃連素對HepG2細胞遷移的作用

討 論

癌癥致死率居高不與癌細胞能夠適應各種惡劣條件密切相關，如血管性介入治療導致的營養缺乏。不僅如此，肝癌還具有很強的侵襲性和轉移性，目前仍然以手術切除為主要治療手段，但術后易轉移、易復發仍然是一大難題。因此，尋找新的化學合成藥物或天然藥物是解決肝癌術后轉移和復發問題的關鍵。

細胞自噬伴隨癌癥發生發展過程，并且扮演重要角色[12]。癌癥發生后，自噬參與癌癥細胞能量供應，促進癌癥發展[11]。抗癌藥物治療能夠誘導癌細胞自噬水平變化，很多手術方式同樣能夠改變細胞自噬水平，如血管介入引起饑餓環境改變癌細胞自噬水平[13]。在藥物或手術干預條件下，癌細胞自噬水平發生變化，其自噬調節作用是否發生變化？自噬作為細胞清除異常折疊蛋白和損傷細胞器的重要方式，一直以來被認為是細胞內環境的保護者[14]。近年來，過量自噬被證明參與細胞死亡調控，自噬也被認為是一種細胞新的死亡方式。如何利用自噬的雙重作用治療癌癥是當前基礎醫學研究所面臨的重要問題之一。此外，目前還未有針對自噬關鍵蛋白LC3B的工具藥物面世，傳統的自噬調控工具藥物3-MA等也很難用于臨床治療。黃連素作為臨床上較為常見的天然藥物，具有殺菌、抗炎、降血壓、降血脂等功效，其對肝癌細胞也表現出明顯的細胞毒性作用。體外實驗表明，黃連素對HepG2的細胞活力有顯著的抑制作用，并且呈現劑量和時間相關性。在此結果上，黃連素對HepG2細胞除了細胞毒性作用，是否還存在其他作用，如抑制其細胞遷移。為探究黃連素對HepG2細胞的遷移作用，我們選擇低劑量的黃連素作用于肝癌細胞，避免因細胞毒性造成遷移實驗假陽性結果。低劑量黃連素尚未表現出顯著的細胞毒性作用，但顯著地抑制HepG2細胞遷移，并且引起肝癌細胞發生自噬。進一步實驗發現，自噬抑制劑3-MA能夠逆轉黃連素對肝癌細胞的遷移抑制作用，這表明黃連素通過自噬抑制肝癌細胞的體外遷移。黃連素干預HepG2細胞后，自噬發揮"有害"作用，抑制HepG2細胞體外遷移，這一結論與傳統認識相悖。從生物體整體角度理解，黃連素干預肝癌細胞后，自噬保護機體不被癌細胞侵犯，維護機體的正常新陳代謝，這與自噬是機體"保護者"觀點相一致。

自噬在不同組織、不同器官中同樣發揮著不同的作用，這也一定程度上體現了自噬在癌癥中的復雜作用[15]。研究自噬與癌癥的關系，應從單器官或單細胞角度出發，以便清晰的揭示自噬在其癌癥發生發展過程中的具體機制。體外細胞模型不能很好的模擬細胞真實的生存狀態，因此自噬相關基因全身敲除小鼠和自噬相關基因條件性敲除小鼠的開發顯得極為重要，也是自噬研究過程的里程碑。山東大學構建了心肌細胞特異性ATG5基因缺失小鼠進行心肌細胞自噬相關研究[16]。上海交通大學為更好地研究腸上皮細胞自噬對腸道微環境的影響，使用了腸上皮細胞特異性敲除ATG5/ATG7基因小鼠[17]。隨著自噬研究的更加深入，自噬與肝癌的關系一定會被深入挖掘。

綜上所述，研究自噬在肝癌發生發展中的作用對未來肝癌臨床治療和術后康復有著重要意義，極有可能為抗癌藥物的開發提供新的靶點和可靠依據。

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