BRCA1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)及臨床意義研究*

崔方博，張豐林，高爾云

安徽省馬鞍山市人民醫(yī)院腫瘤科(馬鞍山 243000)

近年來,非小細(xì)胞肺癌在肺癌中占據(jù)很大比例，因此提高非小細(xì)胞肺癌的治療效果迫在眉睫[1]。雖然治療手段不斷提高，手術(shù)、化療、放療、靶向治療等綜合治療的有效率極為有限，目前非小細(xì)胞肺癌的5年生存率僅17.1%[2]。隨著表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal crowth factor receptor,EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase, ALK)等非小細(xì)胞肺癌驅(qū)動(dòng)基因研究的深入，相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用，取得了顯著的療效[3]。大量研究表明，非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后較差可能是與化療反應(yīng)率低，或?qū)β?lián)合化療過程中產(chǎn)生的原發(fā)或繼發(fā)性藥物耐藥有關(guān)[4]。化療藥物和靶向藥物療效預(yù)測(cè)相關(guān)基因深入研究，極大促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化化療和個(gè)體化靶向治療的發(fā)展和應(yīng)用[5]。乳腺癌易感基因1(Breast cancer susceptibility gene1, BRCA1)被認(rèn)為與非小細(xì)胞肺癌化療療效、預(yù)后等相關(guān)[6]，可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。本文通過檢測(cè)32例非小細(xì)胞肺癌患者的BRCA1基因表達(dá)情況，并分析BRCA1與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討非小細(xì)胞肺癌患者中BRCA1表達(dá)情況及其臨床意義。

資料與方法

1 資料來源 本研究選取2016年1月至2017年12月期間在馬鞍山市人民醫(yī)院住院治療并且通過接受活檢或手術(shù)等方式，病理診斷為非小細(xì)胞肺癌患者32例，排除合并其他惡性腫瘤者。選取每例患者組織中的正常組織和腫瘤組織分別作為對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組。男性20例(62.5%)，女性12例(37.5%)，年齡<60歲17例(53.1%)，≥60歲15例(46.9%);病理類型為腺癌19例(59.3%)，非腺癌13例(40.7%)；分期I-II期4例(12.5%)，III期9例(28.1%),IV期19例(59.3%)；高分化3例(9.38%)，中分化7例(21.9%)，低分化22例(68.8%)；吸煙者17例(53.1%)，不吸煙者15例(46.9%)。

2 主要試劑 BRCA1的PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；EGFR引物由廣州銳博生物科技公司提供；組織蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；RNAiso Plus、Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNase H Plus)(大連寶生物工程有限公司)；Trizol總RNA提取試劑盒(天根公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司)；BCA蛋白定量試劑盒、Beyo ECL Plus試劑盒(碧云天)；抗GAPDH、抗BRCA1單克隆抗體、二抗和熒光二抗(CST)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 HE組織病理學(xué)染色： 分別取對(duì)照組(正常肺組織)和非小細(xì)胞肺癌組的組織，經(jīng)過脫水和石蠟包埋后，分別切成5μmol/L厚的薄片制作切片并用于染色。對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的切片經(jīng)過HE染色封片后，置于正置顯微鏡下觀察兩組組織病理學(xué)差異并且拍照分析，以驗(yàn)證所選取組織為正常肺組織或肺癌組織，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

3.2 免疫熒光染色：分別取對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的肺組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度濃度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)漂洗3次，5 min/次。然后在10% BSA濕盒內(nèi)封閉30min(37 ℃封閉)。然后在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體 (1∶100稀釋抗體)，放在濕盒中，4 ℃孵育過夜。經(jīng)過PBS(pH 7.4) 漂洗3次(5min/次)后，于避光處滴加熒光二抗 (1∶100稀釋抗體)，置于37 ℃濕盒內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。最后經(jīng)緩沖甘油封片，在正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.3 Real-Time PCR分析：將適量的對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的組織迅速轉(zhuǎn)移至含1 ml Trizol試劑中進(jìn)行組織充分研磨使其成為勻漿，室溫靜置5 min，使樣品裂解完全，經(jīng)12000 g，4℃離心5 min后小心取出上清液。在上清液中加入氯仿，混合均勻，室溫靜置5 min后，12000g，4℃離心15 min后小心取出上清液。然后加入相同體積的異丙醇，室溫靜置10 min。12000 g，4 ℃離心10 min，留取沉淀，加入75%乙醇，混合均勻，用來洗RNA沉淀。最后加入RNas-free水使之完全溶解。然后測(cè)定OD260/OD280的比值，測(cè)定RNA濃度。最后根據(jù)說明書，根據(jù)表1所示的引物序列模板進(jìn)行逐步擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR分析。

表1 BRCA1和β-actin mRNA的RT-PCR引物序列

3.4 Western blotting分析：將正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌組織，分別用冰生理鹽水洗2遍，按照全蛋白抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入裂解液，組織勻漿器勻漿1 min后離心收集上清。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將全蛋白提取液與2 × Loading buffer，按照體積比1∶ 1混勻，沸水浴5 min，自然降溫。根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量配制適當(dāng)比例的SDS-PAGE分離膠，凝固1h左右，然后配制5%SDS-PAGE濃縮膠，凝固0.5 h左右。加入電泳緩沖液，將變性的蛋白樣品加入上樣孔中，按照蛋白濃度上樣，使每孔總蛋白含量相同。在220 V恒壓下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部，停止電泳。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，切膠，放入Transfer buffer中，依照膠的大小裁剪一層PVDF膜和6層濾紙，先將PVDF模放入甲醇中浸泡10s，然后將PVDF膜和濾紙放入Transfer buffer中。按照正極-三層濾紙-PVDF模-凝膠-三層濾紙-負(fù)極順序放入轉(zhuǎn)膜儀中，注意邊緣對(duì)齊，防止起泡。在110 V恒壓下轉(zhuǎn)膜2 h。將附有蛋白的PVDF膜放在5%的脫脂奶粉中室溫?fù)u床封閉2 h。將封閉好的膜用TTBS洗5 min，放入相應(yīng)比例的一抗中，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，每次10min，放入對(duì)應(yīng)的二抗中，搖床上室溫孵育3 h，TTBS洗膜3次，每次10 min。凝膠成像儀開機(jī)預(yù)熱30 min，將ECL發(fā)光試劑盒中的A、B兩種試劑等體積均勻混合，滴加在PVDF膜上，充分接觸，避光顯色1 min，用濾紙將膜周圍的多余液體吸干，放入凝膠成像儀中，采用動(dòng)態(tài)積分模式進(jìn)行拍照，觀察結(jié)果。采用Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。

3.5 EGFR基因檢測(cè)： 采集非小細(xì)胞肺癌患者血標(biāo)本，進(jìn)行外周血細(xì)胞DNA的提取和EGFR基因檢測(cè)。抽取研究對(duì)象周圍靜脈血提取DNA。然后根據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)及凝膠電泳對(duì)EGFR基因檢測(cè)。EGFR基因上游引物為5'- CTTCGGGGAGCAGCGATGCGAC- 3'，下游引物為5'- ACCAATACCTATTCCGTTACAC -3'。

結(jié) 果

1 EGFR基因突變情況 32例非小細(xì)胞肺癌患者中，9例患者檢測(cè)出EGFR基因突變，其中包括Exon 19缺失4例(44.4%)、Exon 21(L858R)突變5例(55.6%)。

2 HE染色結(jié)果 通過HE染色可知對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的組織在病理學(xué)上比較具有顯著差異。與正常肺組織相比，非小細(xì)胞肺癌組織結(jié)構(gòu)被破壞，核染色質(zhì)顏色變深，大量癌細(xì)胞產(chǎn)生(圖1)。以此我們區(qū)分正常組織和肺癌組織，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

3 免疫熒光染色結(jié)果 通過免疫熒光法檢測(cè)對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的組織中BRCA表達(dá)情況。與對(duì)照組相比，非小細(xì)胞肺癌組的BRCA1表達(dá)顯著增高(圖2)。

圖1 對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組組織HE染色結(jié)果(×200)

圖2 免疫熒光法檢測(cè)對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組組織中BRCA1表達(dá)情況 (×200)

4 BRCA1 RT-PCR結(jié)果 對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的組織樣本分別提取的總RNA，經(jīng)RT-PCR 后，檢測(cè)出較對(duì)照組，非小細(xì)胞肺癌組中BRCA1顯著升高(圖3)。

5 BRCA1蛋白的Western blotting結(jié)果 分別提取對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的組織樣本蛋白，經(jīng)Western blotting后，檢測(cè)出較對(duì)照組，非小細(xì)胞肺癌組中BRCA1蛋白的表達(dá)顯著升高(圖4)。

6 BRCA1 mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性 BRCA1 mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r的絕對(duì)值越接近1，提示相關(guān)性越強(qiáng)。各臨床病理特征中，腫瘤分期與BRCA1 mRNA相關(guān)性最強(qiáng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.78，P<0.05)；其他臨床病理特征，包括EGFR突變情況等，與BRCA1 mRNA表達(dá)水平無明顯相關(guān)性。提示BRCA1可能在非小細(xì)胞肺癌的疾病發(fā)展過程中有重要作用。

圖3 對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組的組織中

圖4 對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組組織中BRCA1

組 別相關(guān)系數(shù)rP值性別0.0120.673年齡-0.0870.998病理類型0.0980.768分期0.780.032分化程度0.270.361吸煙0.630.068EGFR突變0.140.233

討 論

非小細(xì)胞肺癌長(zhǎng)期以來作為高發(fā)惡性腫瘤嚴(yán)重的威脅著人類的健康[7]。中國(guó)癌癥現(xiàn)狀大數(shù)據(jù)指出，在男性中，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率排在惡性腫瘤中的首位，而在女性中，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率僅此于乳腺癌的發(fā)病率排在第二位[8]。隨著經(jīng)濟(jì)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，非小細(xì)胞肺癌的治療已進(jìn)入個(gè)體化治療階段，尤其是以EGFR、ALK等驅(qū)動(dòng)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物的研發(fā)，在非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療中有著里程碑式的意義，顯著提高了部分患者的生存時(shí)間[9]。

PARP抑制劑Olaparib已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局推薦為BRCA1/2突變的鉑類敏感的復(fù)發(fā)卵巢癌患者的靶向治療[10]，提示了BRCA1作為診治靶點(diǎn)的可行性。BRCA1因與遺傳性乳腺癌有關(guān)，而被研究者在1990年發(fā)現(xiàn)，后發(fā)現(xiàn)BRCA1是具有抑制惡性腫瘤發(fā)生的抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞的正常生長(zhǎng)方面有重要作用[11]。BRCA1在非小細(xì)胞肺癌中可能與鉑類、紫杉類的化療療效相關(guān)[12]。BRCA1的基因狀況可能與非小細(xì)胞肺癌術(shù)后患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[13]。還有研究提示BRCA1的表達(dá)水平與EGFR突變非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后相關(guān)[14]。綜上可知，BRCA1在特定腫瘤類型的發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，可能成為診治非小細(xì)胞肺癌的靶點(diǎn)基因。

本研究選取資料完整的非小細(xì)胞肺癌患者32例，記錄臨床病理特征，并對(duì)EGFR突變的情況進(jìn)行了檢測(cè)。采用HE組織病理學(xué)染色方法區(qū)分正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織，通過免疫熒光染色法、RT-PCR和Western blotting法分別證明了在非小細(xì)胞肺癌中BRCA1 mRNA和蛋白的表達(dá)較正常肺組織均顯著升高。這些結(jié)果提示BRCA1可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生相關(guān)。接著，通過BRCA1 mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)性別、年齡、病理類型、分化程度和吸煙等因素與BRCA1 mRNA表達(dá)水平無明顯相關(guān)性，而非小細(xì)胞肺癌分期與BRCA1 mRNA表達(dá)水平之間具有最強(qiáng)的相關(guān)性，提示BRCA1可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展過程扮演一定的角色。BRCA1的表達(dá)水平與EGFR突變之間沒有明顯相關(guān)性。提示以BRCA1的表達(dá)水平來預(yù)測(cè)化療的療效等診治時(shí)與患者是否存在EGFR突變之間并不互相排斥。本研究樣本量較小，后續(xù)我們將繼續(xù)收集病例，基于更大樣本量對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，提供更加有說服力的結(jié)論。同時(shí)，我們擬在細(xì)胞水平研究BRCA1與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲等特性的關(guān)系，為更深入的機(jī)制研究提供可能。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示BRCA1可能與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程具有密切關(guān)系，有望成為非小細(xì)胞肺癌的疾病預(yù)防、診斷和治療的重要分子標(biāo)志。

[1] Jemal A, Siegel R, Xu J,etal.Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin,2010,60:277-300.

[2] Siegel R, DeSantis C, Virgo K,etal. Cancer treatment and survivorship statistics[J]. CA Cancer J Clin,2012, 62:220-241.

[3] MG Kris，Johnson BE，Berry LD，etal.Using multiplexed assays of oncogenic drivers in lung cancers to select targeted drugs[J]. JAMA，2014,311 (19) :1998.

[4] Guha U, Chaerkady R, Marimuthu A,etal. (2008) Comparisons of tyrosine phosphorylated proteins in cells expressing lung cancerspecific alleles of EGFR and KRAS[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2018,105: 14112-14117.

[5] Lynch TJ, Bell DW, Sordella R,etal. (2004) Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J]. N Engl J Med,2004,350: 2129-2139.

[6] Mo HW, Li LP, Liu Q,etal.ERCC1, BRCA1, RRM1 expression and the relationship between platinum-based chemotherapy in advanced NSCLC patients[J]. Chin J Clin Res, 2011,24:283-284.

[7] Pao W, Miller V, Zakowski M,etal. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from ‘never smokers’ and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101: 13306-13311.

[8] Sequist LV, Martins RG, Spigel D,etal. Firstline gefitinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer harboring somatic EGFR mutations[J]. J Clin Oncol,2008,26: 2442-2449.

[9] Bivona TG, Doebele RC. A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers[J].Nature Medicine, 2016,22(5):472-478.

[10] Husain A, He G, Venkatraman ES,etal. Olaparib maintenance therapy in platinum-sensitive relapsed ovarian cancer[J]. N Engl J Med,2012,366(15):1382-1392.

[11] Quinn JE, Kennedy RD, Mullan PB,etal. BRCA1 functions as a differential modulator of chemotherapy-induced apoptosis[J]. Cancer Res,2006,63: 6221-6228.

[12] Moran T, Wei J, Cobo M,etal.Two biomarker-directed randomized trials in European and Chinese patients with nonsmall-celllung cancer: the BRCA1-RAP80 Expression Customization (BREC) studies[J]. Ann Oncol Nov,2014,25(11):2147-2155.

[13] Harada H, Miyamoto K, Yamashita Y,etal. Methylation of breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) predicts recurrence in patients with curatively resected stage I non-small cell lung cancer[J].Cancer, 2013,119(4):792-798.

[14] Rosell R, Molina MA, Costa C,etal. Pretreatment EGFR T790M mutation and BRCA1 mRNA expression in erlotinib-treated advanced non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations[J]. Clin Cancer Res,2011,17(5):1160-1168.