基因HLA?DR13、CW1及A24表達、BCP突變與HBV感染者性別的相關性

楊小蓉 秦建川 馮致婷 黃演婷 王衛闖

廣東藥科大學附屬第一醫院 1檢驗科，2病理科（廣州510080）

乙型肝炎病毒（HBV）感染后宿主會出現一系列不同的結局：如急慢性肝炎、攜帶者、肝硬化、肝癌［1］或者自動清除病毒并產生保護性抗體。絕大多數流行病學研究表明，HBV感染后存在明顯的性別差異，在無癥狀攜帶者中的男女比例為1.2∶1，慢性肝炎為2.1∶1，重型肝炎肝硬化患者為（3.5 ～ 5.0）∶1，肝細胞癌為6.9∶1［2］。與HBV感染后結局相關的宿主基因HLA?DR13、HLA?A24、HLA?CW1表達、BCP基因突變、T淋巴細胞亞群CD4+/CD8+比值在不同性別人群的相關研究，目前鮮有報道。筆者在前期研究基礎［3］之上，采用實時熒光定量PCR技術檢測患者血液中白細胞HLA?DR13、CW1及A24基因水平，流式細胞儀檢測T淋巴細胞CD4+、CD8+表達，測序法檢測樣本基本核心啟動子（BCP）變異，并分析相關因素與不同性別的人群中的差異表達之間的相關性，為下一步性激素受體信號通路在HBV感染后的作用研究打下基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇在2011年4月至2012年4月來廣東藥科大學附屬第一醫院就診的215例HBV感染者，其中女性感染組42例，男性感染組40例；女性自動恢復組65例，男性自動恢復組68例。男108例，女107例，年齡15～81歲，平均（44±4.4）歲；均排除HAV、HCV、HDV及HEV感染，排除EBV、CMV感染，排除自身免疫性肝病、酒精性肝病及脂肪肝。診斷符合2005年第六次全國傳染病與寄生蟲病會議修訂的《病毒性肝炎防治指南》標準［4］。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 抽取患者靜脈血3 mL，分離血清，用于BCP檢測；抽取EDTA?Na抗凝全血2 mL，運用酚-氯仿-異戊醇方法提取白細胞中DNA，用于檢測HLA?DR13、CW1及A24基因表達備用，并運用流式細胞術（FCM）檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞。

1.2.2 FCM檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞 試驗所用流式細胞儀、免疫熒光標記抗體均為美國BD公司產品。在專用流式檢測管（FACS管）中首先加入單克隆抗體 CD4?FITC/CD8?PE/CD3?PE?Cys 2 μL，加入25 μL EDTA?Na抗凝混勻全血，混勻后避光孵育30 min后加入溶血素500 μL，混勻后室溫避光溶血15 min，用2 mL PBS洗液洗滌，混勻后離心（1 500 r/min，5 min），棄上清液后重復一次洗滌程序。最后加入500 μL PBS洗液，混勻后避光放置，上機檢測。

1.2.3 檢測HLA?DR13、A24*1、CW1基因表達引物合成及測序均在上海生物工程公司完成，電泳儀為北京六一儀器廠，pMD載體為日本TAKARA公司產品，在HLA?DR13、A24*1、CW1序列（Genbank登錄號：HSU58978、AH004915.2、AH011749.2）CDS區域設計 3 對引物：5′?CCTGGACAGATACTTC?CATAACCA?3′，5′?TCGTCTTCCAGGATGTCCTTCT?3′［3］；5′?AGGTATTTCT CCACATCCGTGTCC?3′，5′?CTTTCCCTGTCTCCTCGTCCC?3′；5′?CGCTTCATCT?CAGTGGGCTACG?3′，5′?GCTCACTCGGTCAGTCT?GTGCC?3′。普通PCR擴增出135、184、171 bp的片段后，連接，轉化，測序，酶切鑒定后，連接載體pMD20，按照104～107copies/mL稀釋倍數稀釋，實時熒光定量PCT檢測各稀釋倍數質粒（反應條件：95℃變性30 s，95℃ 5 s，60℃退火30 s，30個循環）。最后制作標準曲線，檢測各組HLA?DR13、A24和CW1基因表達量。

1.2.4 擴增BCP序列 運用等位基因擴增方法，在HBV的X基因BCP序列（Genbank登錄號：NC_003977）BCP1762/1764突變位點處設計3個引物：5′?AATGGTCTTTGTACTAGGAG?3′，5′?AAAGATC?TTTGTACTAGGAG?3′，5′?ATGTTCCGGAGACTCTA?AG?3′，擴增出312 bp的片段，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送公司測序。

1.3 統計學方法 運用SPSS 17.0分析，所有的定量值均以log10對數轉換，計量資料組間差異比較用方差分析，陽性率的比較采用卡方檢驗，以α=0.05為檢驗標準，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HLA?DR13、A24*1及CW1定量結果比較 HLA?DR13以男性HBV感染組最低，與女性感染組及男、女自動清除組結果比較差異有統計學意義（P=0.009，0.032，0.004，P＜ 0.05），而女性HBV感染組及男、女自動清除組HLA?DR13表達量較高，組間差異無統計學意義（P＞0.05）；4組HLA?A24和HLA?ACW1的結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組病例HLA?DR13、HLA?A24及HLA?CW1基因real?time PCR定量結果比較Tab.1 Comparison of HLA?DR13，HLA?A24 and HLA?CW1 levels among four groups ±s

表1 4組病例HLA?DR13、HLA?A24及HLA?CW1基因real?time PCR定量結果比較Tab.1 Comparison of HLA?DR13，HLA?A24 and HLA?CW1 levels among four groups ±s

注：與其他3組比較，*P＜0.05

組別HBV感染組(女性）HBV感染組（男性）HBV自動清除組（女性）HBV自動清除組（男性）例數42 40 65 68 HLA?DR13 2.72±1.86 1.76±1.02*2.69±2.10 2.56±1.68 HLA?A24 2.30±1.82 2.26±1.90 2.22±1.63 2.13±1.67 HLA?CW1 2.16±1.95 2.25±1.80 2.31±1.87 2.20±1.64

2.2 各組T細胞亞群結果 以男性HBV感染組CD3+CD4+T細胞百分率最低，與其他3組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），男女自動清除組顯著大于男女感染組，差異有統計學意義（P＜0.05）；4組CD8+T細胞百分率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；以女性HBV感染組CD4+/CD8+結果最低，男性HBV感染組其次，男女HBV感染組與男女自動清除組相比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組T細胞CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+結果比較Tab.2 Comparison of CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+results among four groups ±s，%

表2 各組T細胞CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+結果比較Tab.2 Comparison of CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+results among four groups ±s，%

注：與其他3組比較，*P＜0.05

組別HBV感染組（女性）HBV感染組（男性）HBV自動清除組（女性）HBV自動清除組（男性）例數42 40 65 68 CD3+CD4+34.15±9.09*31.63±9.20*39.72±7.02 39.69±6.68 CD3+CD8+26.99±7.88 24.82±9.05 21.50±3.82 22.35±4.69 CD4+/CD8+1.39±0.61*1.47±0.77*1.88±0.38 1.82±0.37

2.3 4組各檢測項目相關性比較 HLA?DR13與HLA?A24及CD4+結果呈顯著正相關（P＜ 0.05），HLA?A24與HLA?CW1呈顯著正相關（r=0.42，P=0.000），CD4+T細胞結果與CD4+/CD8+呈顯著正相關（r=0.60，P=0.000），CD8+T細胞結果與CD4+/CD8+呈顯著負相關（r=-0.71，P=0.000），見表3。

表3 各組HLA?DR13、A24、CW1、CD4+、CD4+/CD8+之間相關性Tab.3 Association of HLA?DR13，A24 CW1，CD4+，CD4+/CD8+results

2.4 BCP電泳及測序結果 運用等位基因擴增PCR法，擴增出312 bp片段，見圖1。測序后男女陽性率比較結果見圖2，女性HBV感染組BCP突變率為0.24（10/42），且全部為單突變，而男性HBV感染組突變率為0.19（13/68），其中單突變為0.16（11/68），雙突變為0.03（2/68），與女性HBV感染組結果比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 HBV感染組BCP突變電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of BCP gene mutation in patients with HBV infection

圖2 男女BCP突變率的比較Fig.2 Comparison of the ratio of BCP gene mutation in male and female

3 討論

慢性HBV感染后的發生發展是一個多種因素合力作用的結果，除了環境和病毒的相互作用外，疾病的最終轉歸主要取決于宿主的免疫功能狀態，與遺傳相關的免疫因素可能是導致HBV相關肝臟疾病的主要機制［5］。人類白細胞抗原（HLA）基因復合體所表達的基因產物，除直接構成異體移植排斥反應的靶抗原外，在免疫應答的過程中發揮著非常重要的調控作用，也反映了自身免疫性疾病的基因易感性［6］，與HBV感染后臨床結局密切相關，ALBAYRAK 等［7］的研究表明：接種乙肝疫苗后，非應答者的HLA?A24及HLA?A11頻率顯著高于乙肝疫苗有應答者，而非應答者的HLA?CW6的頻率顯著低于乙肝疫苗有應答者。HBV感染后的發展結局有明顯的性別差異，流行病學研究［8］表明，在感染HBV后發展為肝癌的男性約為女性的3倍。本研究中，將82例HBV感染后的患者分為男性組和女性組，將133例自動清除HBV者根據性別分為男性和女性組，通過熒光定量PCR分析，HLA?DR13以男性HBV感染組最低，與女性感染組及男、女自動清除組結果比較差異有統計學意義（P＜ 0.05），4組HLA?A24和HLA?CW1的結果之間差異無統計學意義（P＞0.05）。相關性分析發現了 HLA?DR13基因及 CD4+、CD4+/CD8+之間屬于正相關關系，而男女感染組與男女自動清除組的CD4+及CD4+/CD8之值相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。在感染HBV后，機體主要以3種途徑清除病毒：（1）T淋巴細胞CD8+CTL直接殺滅途徑；（2）CTL直接誘導表達呈遞病毒抗原的肝細胞凋亡；（3）CTL產生和分泌非細胞毒性淋巴因子，抑制病毒基因的表達和病毒基因組的復制，從而干擾病毒的生活周期；HLA?DR屬于HLAⅡ類分子，在機體對HBV的免疫應答過程中，肝組織內的巨噬細胞可以表達高水平的高效遞呈病毒抗原給HLAⅡ類分子限制的CD4+T細胞，CD4+T細胞的主要作用是通過分化成不同的細胞群而間接調節免疫應答［9］，如果肝組織受到損傷導致CD4+表達量不足，影響CD4+T細胞被激活，進而影響到分化的Th1和Th2細胞，導致細胞免疫和體液免疫途徑受到影響，對人肝細胞移植（HUHEP）小鼠模型的研究結果表明，HBV感染的小鼠炎癥及免疫抑制細胞因子程度與肝內CD4+T細胞數量相關，病毒載量高的小鼠會引起肝臟祖細胞的感染，這可能是導致肝癌發生的新機制［10］。由此可見，在本研究中HLA?DR13與CD4+T細胞表達呈正相關，也可能是HLA?DR13遞呈的HBV核心抗原可誘導更為強烈的CD4+T細胞增殖反應，進而影響到乙型肝炎病毒感染宿主后能否自動被清除。HLA?A24與HLA?DR13及CW1呈正相關關系，但是在4組比較中均無統計學意義，可能與HLA?A24與乙肝疫苗的反應性有關，而HLA?CW1則與臨床抗病毒治療后的療效相關［11］。

HBV為嗜肝病毒，為雙鏈DNA，病毒在復制的時候需先轉錄成RNA（前病毒基因組），然后再逆轉錄成子代病毒DNA。病毒編碼有逆轉錄酶，其基因結構共有4個開發閱讀框（ORF）：S、C、P和X，編碼7種病毒蛋白：即S區的前S1和S2蛋白和主蛋白（HBsAg），C區包括前C區及核心區，基本核心啟動子區（BCP）位于核心區內，C區編碼HBeAg和HBcAg蛋白，P區編碼P蛋白和X區編碼HBxAg蛋白［12］。HBV復制的過程中，通常會由于多種因素導致序列突變，而最常見的突變莫過于逆轉錄酶經常性發生的隨機錯誤，BCP區和前C區是其中最常見的突變域，亦有研究表明：HBV有調節宿主細胞表達和甲基化的能力，從而導致突變［13］。本研究的數據表明：病毒因素也有性別差異，BCP突變檢測結果為：女性HBV感染組BCP且全部為單突變，突變率為24%，且全部為攜帶者，與相關研究結果［14］（無癥狀病毒攜帶者中的前C區突變率高于慢性乙型肝炎及急性肝炎患者，它們的發生率分別為33.7%、16.1%、13.6%）較為接近；而男性HBV感染組突變率其中單突變為16%，雙突變為3%，與女性HBV感染組結果比較差異有統計學意義（P＜0.01）。進一步提示BCP突變對于男性而言，雄激素途徑在分子水平上通過靶向病毒增強子Ⅰ而起到增強HBV轉錄作用［15］，進而加重病情，導致男女感染HBV后不同的臨床結局。

感染性疾病的遺傳易感性受到多種層次水平和途徑的制約，除了宿主的HLA、淋巴細胞共刺激分子及其配體和病毒因素外，還跟腸道菌群結構及豐度相關［16］，這些因素均會直接影響感染的起始和疾病的進程。本研究中HLA?DR13、A24、CW1、T淋巴細胞功能及病毒因素的性別差異為下一步雌激素/雄激素受體信號通路研究奠定了基礎，為進一步揭開性別差異引起的HBV感染后的不同結局，從而有的放矢地實行精準治療提供思路。

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