雙氫青蒿素對MRL/lpr SLE小鼠CD4+T細胞基因組DNA甲基化水平的影響研究

陳紅波 項曉駿 范軍芬 郭小文 壽旗揚 馬紅珍 范永升

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫介導引起多臟器損傷的彌漫性結締組織病，需要長期用藥治療。但長期應用激素類和免疫抑制劑類藥物會引發嚴重的不良反應[1]。青蒿素作為祖國傳統醫藥的代表在治療瘧疾上取得了令人矚目的成績，近年來研究發現青蒿素類衍生物在SLE的治療上也有一定作用[2]。青蒿素類衍生物SM934可以減少SLE小鼠自身抗核抗體產生，減輕小鼠腎損傷，延長SLE小鼠生命[3]。DNA甲基化調控在SLE發生、發展中起重要作用，SLE患者CD4+T細胞基因組DNA普遍存在低甲基化，這種低甲基化狀態可誘導SLE發病或加重[4-5]。基于此，本研究旨在探討青蒿素類衍生物雙氫青蒿素是否通過影響MRL/lpr SLE小鼠CD4+T細胞DNA甲基化水平，從而發揮其治療作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 6周齡SPF級雌性MRL/lpr SLE小鼠5只，體重（31.6±1.9）g，由上海萊克實驗動物有限責任公司提供。RPMI1640培養液（美國Gibco公司）、FBS（美國Hyclone公司）、雙氫青蒿素（純度98%）（上海伊卡生物技術有限公司）、CD4（L3T4）-MicroBeads Kit（德國 MiltenyiBiotec公司）、Anti-mouse CD3-FITC（美國Abcam公司）、Anti-mouse CD4-PE（美國 Abcam公司）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）（七海生物公司）、TIANamp Genomic DNA Kit（美國TIANGEN公司）、流式細胞儀（美國BD公司）、倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、高效液相色譜儀LC-10ATvp（日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 磁珠抗體分選CD4+T細胞 處死MRL/Lpr SLE小鼠后，無菌條件下取出脾臟，制備脾臟單核細胞懸液（107個/ml）。取1×107個細胞用PBS重懸細胞，按照免疫磁珠分選柱說明書操作分離CD4+T細胞，流式細胞儀檢測CD4+T細胞純度。

1.2.2 細胞原代培養、傳代、分組及藥物干預 從小鼠脾臟分離出來的CD4+T原代細胞，進行培養傳代（37℃、RPMI1640細胞培養液、5%二氧化碳培養箱），傳至第3代后進行藥物干預。

1.2.3 CCK-8檢測雙氫青蒿素細胞毒性 將稀釋后的CD4+T細胞加入96孔細胞培養板，每孔加入1×104個細胞，每孔依次加入不同劑量的雙氫青蒿素，使其終濃度為 0、10、20、40、60、80、100μmol/L（分別為對照組，10、20、40、60、80、100μmol/L 組），設置 3 個重復孔及空白對照（不加細胞）；37℃，5%二氧化碳飽和濕度培養48h，加入 20μmol/L CCK-8，避光孵育 1h；酶標儀測定每孔450nm波長吸光度，計算半抑制濃度（IC50）和雙氫青蒿素的細胞毒性。

1.2.4 高效液相色譜檢測基因組DNA甲基化水平

1.2.4.1 基因組DNA提取和水解：按照DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，然后將1μg DNA樣品溶于3μl去離子水中，高溫變性后冰浴，加入1μl 0.1mol/L醋酸銨（pH5.3）、1μl核酸酶 P1（2U/μl）、1μl 1mol/L 碳酸氫銨（pH5.3）和 1μl磷酸二酯酶（0.002U/μl），在 37℃下反應2h后加入1μl堿性磷酸酶（0.5U/μl），繼續反應1h。水解完全的DNA樣品凍存在-20℃待分析。

1.2.4.2 高效液相色譜檢測基因組DNA甲基化水平采用島津液相色譜系統（LC-10AT vp），根據5種堿基的性質和分離效果，得到最佳色譜條件如下：色譜柱，phenomenex C18 柱 （4.6～250mm，5μm）；流動相，0.01mol/L磷酸二氫鉀：甲醇（體積比15：85）；柱溫，25℃；流速，1.2ml/min；檢測波長，260nm；進樣量，20μl。腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶標準品的濃度為1、5、10、50、100μmol/L，5- 甲 基 胞 嘧 啶 為 0.05、0.25、0.50、2.50、5.00μmol/L，用于制備標準曲線。

1.2.5 熒光定量PCR檢測DNA甲基化轉移酶1（DNMT1）、生長阻滯和 DNA 損傷基因 a（Gadd45a）mRNA表達水平（1）RNA抽提：利用Trizol抽提MRL/lpr SLE小鼠CD4+T細胞總RNA，紫外分光光度計測定濃度。（2）逆轉錄：反應體系為（20.0μl）：total RNA（5μl）,Random Primer p（dN）6（0.2μg/μl，1μl），Rnase-free ddH2O（5μl），5×Reaction Buffer（4.0μl）,dNTP Mix（10mmol/L，2.0μl），Rnase inhibitor（20U/μl，1.0μl），AMV Reverse Transcriptase（10U/μl，2.0μl）。（3）PCR 擴增：引物如下：反應體系（20μl）：ddH2O（7μl），2×SYBR Premix Ex TaqTM（10μl），引物 F（10μmol/L，1.0μl），引物 R（10μmol/L，1.0μl），模板 cDNA（1.0μl）。反應條件：95℃（3min）；40 個循環（95℃，15sec）；60℃，40sec（收集熒光）。完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在熒光定量PCR儀中進行反應。

1.2.6 Western blot檢測DNMT1和Gadd45a蛋白表達水平 將蛋白樣品加入4×SDS緩沖液中，沸水煮沸后12 000g離心1min；取一定量總蛋白加入SDS-PAGE凝膠上樣孔內，垂直電泳槽跑膠電泳后，將PVDF膜在甲醇中浸泡，轉移電泳槽轉膜后，將PVDF膜至于Blocking Buffer中，加入一抗，4℃孵育過夜，洗滌后加入二抗，室溫孵育2h，洗滌將PVDF膜平放在顯色板上，ECL底物滴加在膜表面，化學發光儀收集信號。

1.3 觀察指標 （1）比較不同濃度雙氫青蒿素對CD4+T細胞的毒性；（2）比較不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞基因組DNA甲基化水平；（3）比較不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達水平；（4）比較不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分選后CD4+T細胞的純度 應用免疫磁珠法分選CD4+T細胞，結果顯示純度達到89.96%，分選后的CD4+T細胞狀態良好，滿足后續實驗需求。

2.2 不同濃度雙氫青蒿素對CD4+T細胞的毒性比較對照組，10、20、40、60、80、100μmol/L 組 CD4+T 細胞450nm 波長吸光度分別為 0.935±0.022、0.846±0.012、0.677±0.012、0.627±0.019、0.486±0.014、0.351±0.017、0.262±0.013，10、20、40、60、80、100μmol/L 組 CD4+T 細胞抑制率分別為 10.07%、29.12%、34.72%、50.66%、65.88%、75.91%。雙氫青蒿素對SLE小鼠CD4+T的IC50為62μmol/L。雙氫青蒿素可抑制CD4+T細胞增殖，且在實驗范圍內，隨著濃度的增加，對CD4+T細胞增殖的抑制作用增強。

2.3 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞基因組DNA甲基化水平比較 對照組與40、60、80μmol/L組CD4+T細胞基因組DNA甲基化水平分別為（3.114±0.122）%、（3.375±0.071）%、（3.540±0.076）%、（3.639±0.104）%，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05）。即雙氫青蒿素處理后，CD4+T細胞基因組DNA甲基化水平顯著升高；且雙氫青蒿素濃度越高，基因組DNA甲基化水平越高。

2.4 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達水平比較 見表1。

表1 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達水平比較

由表1可見，不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a mRNA表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05）。即雙氫青蒿素處理后，CD4+T細胞DNMT1 mRNA表達上調，而Gadd45a mRNA表達下調；且雙氫青蒿素濃度越高，DNMT1 mRNA表達水平越高，Gadd45a mRNA表達水平越低。

2.5 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達水平比較 見圖1、表2。

圖1 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達電泳圖（a：對照組；b：40μmol/L 組；c：60μmol/L 組；d：80μmol/L 組）

表2 不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達水平比較

由圖1、表2可見，不同雙氫青蒿素濃度組CD4+T細胞DNMT1和Gadd45a蛋白表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05），組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05）。即雙氫青蒿素處理后，CD4+T細胞DNMT1蛋白表達上調，而Gadd45a蛋白表達下調；且雙氫青蒿素濃度越高，DNMT1蛋白表達水平越高，Gadd45a蛋白表達水平越低。

3 討論

SLE是一種機體免疫功能異常導致多系統受損的慢性自身免疫性疾病[6]。SLE患者CD4+T細胞基因組DNA普遍存在低甲基化，這與SLE患者體內甲基化調節基因表達異常有關[4-5]。DNMT1是DNA甲基化轉化過程中最關鍵的限速酶，維持基因組DNA甲基化水平，其酶活性與濃度與甲基化水平呈正相關。在SLE患者中，DNMT1濃度及酶活性明顯下降，導致基因組DNA呈低甲基化[7]。Gadd45a是一種重要的DNA甲基化抑制蛋白，它通過促進DNA修復，去除DNA甲基化標記，誘導甲基化敏感基因表達。Gadd45a基因在SLE患者CD4+T細胞中高表達，與SLE病情嚴重程度呈顯著正相關[8-9]。

屠呦呦課題組發現雙氫青蒿素治療SLE療效肯定，且無明顯毒副反應[10]。Huang等[11]發現雙氫青蒿素可能是通過抑制TLR4/IRF/IFN信號通路，從而抑制LPS誘導的脾細胞活化，顯著減少LPS誘導的脾細胞中IFN-α和IFN-β的產生，起到對MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用。徐麗敏等[12]發現雙氫青蒿素通過阻止B細胞增殖，促進CD8+T細胞增殖，從而直接和間接抑制B細胞活性，減少自身免疫抗體產生，達到治療SLE的作用。

本研究結果發現，雙氫青蒿素通過上調DNMT1表達和下調Gadd45a表達，升高SLE小鼠CD4+T細胞基因組DNA甲基化水平，從而減少自身免疫抗體產生，進而達到治療SLE的作用。本研究主要是在體外細胞實驗中證實了雙氫青蒿素對SLE小鼠的治療作用，在小鼠體內探討其生物學作用將是進一步研究的方向。

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