沉默β-catenin表達對胃癌MGC-803細胞生物學行為的影響與作用機制研究

潘安萍 朱建偉 王忻妍

β-鏈蛋白（β-catenin）是一種多功能的蛋白質。在正常細胞內，β-catenin多數位于細胞膜，與E鈣黏蛋白及α-catenin一起在細胞間的黏附中發揮關鍵作用[1]。β-catenin若脫離細胞膜進入細胞質，易被降解，但當β-catenin在細胞內發生降解異常時，β-catenin會在細胞內堆積，進入細胞核促進下游靶基因的轉錄，即β-catenin的另一重要功能-參與Wnt信號通路[2]。β-catenin下游靶基因編碼許多調節細胞生物學行為的相關蛋白，如 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、基質金屬蛋白酶（MMP）-7等，即β-catenin作為轉錄因子有可能影響細胞增殖、分化、侵襲、轉移等多種生物學行為，且有研究發現β-catenin在多種腫瘤細胞中明顯高表達[3]。基于此，本研究應用干擾慢病毒感染β-catenin相對高表達的胃癌細胞株MGC-803，沉默其細胞內β-catenin表達，而后通過多種實驗方法觀察β-catenin表達下調對MGC-803細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移等生物學行為的影響，同時檢測沉默β-catenin表達后的MGC-803細胞中Bcl-2、Bax、cyclin D1和MMP-7等蛋白表達水平的變化，初步探討β-catenin下調影響胃癌MGC-803細胞生物學行為可能的作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞與主要試劑 MGC-803細胞株購自上海博谷生物科技有限公司。β-catenin-RNAi慢病毒液、βcatenin-Neg慢病毒液購于上海吉瑪公司；凋亡檢測AnnexinV-PE/7-AAD試劑盒、細胞周期碘化丙啶（PI）染色試劑盒購于南京凱基生物有限公司；Matrigel膠購于美國BD公司；兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國Santan Cruz公司；鼠抗人β-actin、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP單克隆抗體均購于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 分別將購買的β-catenin-RNAi慢病毒及β-catenin-Neg慢病毒感染MGC-803細胞，實驗分組：實驗組（感染β-catenin-RNAi慢病毒的MGC-803-RNAi細胞）、陰性對照組（感染空載慢病毒的MGC-803-Neg細胞）、空白對照組（未處理的MGC-803細胞）。

1.2.2 病毒感染與細胞培養 根據預實驗得知該病毒對MGC-803細胞的感染復數約為100，將MGC-803細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后實驗組與陰性對照組細胞分別滴加相應慢病毒液，空白對照組加等體積培養基。24h后換液，3d后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞熒光染色情況。感染效率=帶綠色熒光細胞數/總細胞數×100%。

1.2.3 Western blot檢測細胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7表達水平 用蛋白提取試劑盒提取各組細胞內的總蛋白，分別取20μl進行聚丙烯凝膠電泳，結束后目的蛋白條帶轉移至硝酸纖維素（NC）膜，5%的脫脂奶粉封閉1h，一抗（1:1 000）4℃封閉過夜，二抗（1:2 500）室溫封閉1h。暗室內用發光液進行曝光、顯影、定影，得到目的蛋白條帶的膠片，用Image J軟件檢測各組細胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7相對表達水平。實驗重復3次取平均值。

1.2.4 Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細胞術檢測各組細胞凋亡率 將各組細胞分別接種于6cm培養皿常規培養。待細胞長至約80%～90%融合度時收集細胞，PBS洗滌2次，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，加入1 μl Annexin V-PE染液，室溫、避光、反應15min，加入5 μl 7-AAD染液，室溫、避光、反應15min。過300目尼龍網后1h內進行流式細胞術檢測細胞凋亡率。實驗重復3次取平均值。

1.2.5 PI單染流式細胞術檢測各組細胞周期 取各組細胞分別接種于6cm培養皿常規培養，待細胞長至約80%～90%融合度時收取細胞，每組細胞取約1×105個。用PBS清洗2次后用預冷的75%乙醇溶液1ml重懸細胞沉淀，4℃固定過夜。第2天1 000r/min離心5min后去固定液，PBS清洗2次，加入100μl的RNase A重懸細胞沉淀，置于37℃水浴鍋內30 min，加入PI染料400μl，4℃避光染色30min。過300目尼龍網后，流式細胞術檢測細胞周期。實驗重復3次取平均值。

1.2.6 Transwell法檢測細胞的侵襲能力 將融好的Mtrigel膠與含10%BSA的1640培養基按體積比1:6混合，后取50μl平鋪于小室的上室面。收集各組細胞，PBS清洗2次，用完全培養基稀釋成1×105/ml的細胞懸液。小室的下室面各加入含10%FBS的1640完全培養基500μl，上室面加入200μl各組細胞懸液，培養24h后取出小室，擦拭上室面未穿膜的細胞后結晶紫染色，顯微鏡下計數穿膜細胞數分析細胞侵襲能力。實驗重復3次取平均值。

1.3 觀察指標 觀察并比較MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞熒光染色情況、β-catenin 表達水平、細胞凋亡率、細胞周期、侵襲能力，以及Bcl-2、Bax、cyclin D1、MMP-7 蛋白表達水平。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件；計量資料以表示，3組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞熒光染色情況比較 感染4d后，熒光顯微鏡下可見MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞顯示強綠色熒光，且帶綠色熒光的細胞數占總細胞數比例均超過80%，而MGC-803細胞無綠色熒光，即MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞慢病毒感染效率＞80%。MGC-803-RNAi細胞熒光染色情況見圖1（插頁）。

圖1 MGC-803-RNAi細胞熒光顯微鏡下所見（×100）

2.2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞β-catenin表達水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞β-catenin相對表達水平分別為0.8725±0.0110、0.8593±0.0074、0.4220±0.0164，3 組比較差異有統計學意義（P＞0.05），MGC-803-RNAi細胞β-catenin表達水平較MGC-803、MGC-803-Neg細胞下調（均P＜0.05），而MGC-803-Neg細胞與MGC-803細胞間比較無統計學差異（P＞0.05）。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞 β-catenin蛋白電泳圖比較見圖2。

圖2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞 β-catenin蛋白電泳圖比較（a：MGC-803 細胞；b：MGC-803-Neg細胞；c：MGC-803-RNAi細胞）

2.3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞凋亡率比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞凋亡率分別為（1.20±0.26）%、（1.35±0.35）%、（8.52±0.82）%，3組比較差異有統計學意義（P＞0.05），MGC-803-RNAi細胞凋亡率高于 MGC-803、MGC-803-Neg細胞（均P＜0.05），而 MGC-803-Neg細胞與MGC-803細胞間比較無統計學差異（P＞0.05）。流式細胞術檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞凋亡率比較見圖3。

圖3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞凋亡率比較（a：MGC-803 細胞；b：MGC-803-Neg細胞；c：MGC-803-RNAi細胞）

2.4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞周期比較 以S/G1期細胞比例為觀察指標，MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞分別為 （1.11±0.05）%、（1.09±0.10）%、（0.78±0.08）%，3 組比較差異有統計學意義（P ＞0.05），MGC-803-RNAi細胞 S/G1期比例低于 MGC-803、MGC-803-Neg細胞（均P＜0.05），而MGC-803-Neg細胞與MGC-803細胞間比較無統計學差異（P＞0.05）。流式細胞術檢測MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞周期結果比較見圖4（插頁）。

圖4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞周期結果比較（a：MGC803 細胞；b：MGC803-Neg細胞；c：MGC803-RNAi細胞）

2.5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞侵襲能力比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞穿膜染色數分別為（109.80±5.36）、（104.40±7.47）、（54.00±6.28）個，3 組比較差異有統計學意義（P＞0.05），MGC-803-RNAi細胞侵襲能力低于 MGC-803、MGC-803-Neg細胞（均P＜0.05），而 MGC-803-Neg細胞與MGC-803細胞間比較無統計學差異（P＞0.05）。Transwell法檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞侵襲能力實驗結果見圖5（插頁）。

圖5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi穿膜細胞顯微鏡下所見比較（a：MGC803 細胞；b：MGC803-Neg 細胞；c：MGC803-RNAi細胞；結晶紫染色，×200）

2.6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi 細胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7蛋白表達水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白表達水平比較差異均有統計學意義（均P＞0.05），MGC-803-RNAi細胞Bcl-2、cyclin D1、MMP-7蛋白表達水平均低于MGC-803、MGC-803-Neg細胞（均P＜0.05），Bax蛋白表達水平高于 MGC-803、MGC-803-Neg細胞（均P＜0.05），而MGC-803-Neg細胞與MGC-803細胞間比較無統計學差異（P ＞0.05）。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7 蛋白電泳圖比較見圖6。

3 討論

β-catenin是一種多功能、進化保守的蛋白質分子，在多細胞生物的胚胎發育及機體穩態中發揮至關重要的作用。研究發現，在腫瘤的發生、發展過程中，一方面β-catenin作為一種轉錄活化因子，能介導多種原癌基因與細胞周期調控基因的轉錄翻譯，促進細胞增殖、侵襲及轉移，抑制細胞分化、凋亡，還能誘導腫瘤耐藥，另一方面，腫瘤細胞中β-catenin在細胞質內的異常定位導致細胞膜上β-catenin含量下降，易使癌細胞間黏附功能下降，致腫瘤細胞更易于脫離原發部位而發生遠處轉移[3]。β-catenin參與調控上述生物學行為的靶基因編碼蛋白包含 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、MMP-7、P-gp等[3]。本研究選取β-catenin相對高表達的胃癌MGC-803細胞進行實驗，通過干擾慢病毒感染MGC-803細胞，經感染成功的MGC-803細胞在熒光顯微鏡下有明顯的熒光顯示；并通過Western blot法證實MGC-803-RNAi細胞β-catenin表達水平明顯下調。本研究再將此穩定穿代的3株細胞（MGC-803-RNAi、MGC-803-Neg及MGC-803細胞）進行后續實驗，以了解βcatenin表達下調對MGC-803細胞生物學行為的影響及其可能的作用機制。

圖6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白電泳圖比較（a：MGC-803細胞；b：MGC-803-Neg細胞；c：MGC-803-RNAi細胞）

本研究采用Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細胞術證實β-catenin表達的下調可促進MGC-803細胞凋亡。這與在腸癌細胞中得到的結果一致[4]。細胞凋亡過程主要受Bcl-2蛋白家族所調控，其中最具代表性的為Bax及Bcl-2蛋白，Bax促進細胞凋亡，而Bcl-2抑制細胞凋亡[5]。本研究檢測到沉默β-catenin表達之后的MGC-803-RNAi細胞Bcl-2表達水平明顯下調，而Bax表達水平則相對上調，結果同預期。筆者推測，β-catenin表達異常對MGC-803細胞凋亡的影響，其機制與影響Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白Bax及Bcl-2的表達有關。cyclin是一類在細胞周期中發揮關鍵調節作用的蛋白，其中cyclin D1能調細胞周期由G1期順利進入到S期[6]。本研究干擾MGC-803細胞β-catenin的表達后發現MGC-803-RNAi細胞cyclin D1表達水平也下調，且出現明顯的G1期阻滯，細胞增殖減弱。這與Shtutman等[7]研究結果相符。筆者推論，沉默β-catenin表達使MGC-803細胞阻滯在G1期，其作用機制與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白cyclin D1表達下調有關。

胃癌細胞轉移是胃癌患者治療失敗的主要原因。β-catenin作為細胞黏附中的關鍵因子，當其在細胞膜中減少時，細胞間黏附功能下降，導致腫瘤細胞易脫離原發部位。但是游離出來的腫瘤細胞要在細胞間質中進行遷徙，必須能夠分解細胞外基質。在細胞外基質的眾酶中，MMP起著關鍵的作用[8]。研究顯示，MMP家族蛋白酶的表達受Wnt/β-catenin信號通路調控，其中MMP-7蛋白與腫瘤關系最密切，MMP-7普遍被發現在腫瘤組織及細胞中明顯高表達，且MMP-7在相對晚期的胃癌組織中陽性率明顯高于相對早期的胃癌組織[9]。本研究通過Transwell實驗方法發現，沉默β-catenin表達之后，MGC-803-RNAi細胞的侵襲力顯著下降，且MGC-803-RNAi細胞內MMP-7的表達水平也明顯下降。因此推論β-catenin沉默抑制MGC-803細胞侵襲能力與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白MMP-7表達水平下調有關。這一結果與在腸癌、食管癌中的研究相似[10]。

綜上所述，本研究結果顯示，β-catenin表達下調可影響胃癌MGC-803細胞的增殖、凋亡、侵襲等多種生物學行為，其作用機制可能與影響Wnt/β-catenin信號通路下游多種靶蛋白表達有關。

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