IL-12B基因多態性及單倍型與克羅恩病的關系研究

郭茂東 王群英 陳燕萍 滕衛軍 馬擁軍 楊小云 韋煒 丁進

克羅恩病（Crohn′s disease，CD）是一種累及全消化道的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，病因至今未明。遺傳免疫學因素在其發病中的作用一直備受關注[1]。以Th1細胞亞群異常極化為特點的細胞免疫應答失衡已被證實是CD的重要發病機制之一[2]。IL-12可促進原始T淋巴細胞向Th1細胞分化，并誘導Th1細胞分泌干擾素γ、TNF-α等炎癥因子,在調節細胞免疫反應中起重要作用[3]。研究發現，CD患者腸黏膜IL-12 mRNA表達上調[4]。同時，動物實驗表明給予外源性IL-12不僅會使小鼠結腸炎癥加重，且更易發生爆發性結腸炎，甚至死亡[5]，而采用特異性抗體封閉IL-12則能明顯減輕小鼠結腸炎癥癥狀[6]。這些研究表明，IL-12可能在CD的發生、發展中起關鍵作用。IL-12由p40和p35 2個亞基組成，其中p40亞基的表達只局限于巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞，對IL-12的表達水平具有決定性作用[7]。IL-12 p40表達受其IL-12B遺傳多態性影響[8]。目前，日本及部分高加索人群的研究證實IL-12B基因多態性與CD易感性相關[9-10]，我國漢族人群CD與IL-12B基因多態性的相關性報道少見。一項關于亞洲人群的研究表明rs3212227和rs6887695是IL-12B的2個常見功能性單核苷酸多態性（SNP）位點[11]。本研究探討這2個SNP位點與CD易感性的關系，旨在為進一步闡明CD的遺傳免疫學發病機制提供理論參考，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年1月至2017年12月金華市中心醫院、金華市人民醫院消化內科收治的CD患者94例（CD組）。CD診斷標準參照“炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012年，廣州）”[12]。患者均經臨床、實驗室、電子結腸鏡、放射影像學及病理組織學檢查等明確診斷；按結腸鏡下CD病變范圍分為回腸型40例、結腸型12例、回結腸型42例，其中結腸型和回結腸型合并為結腸病變CD組；按疾病類型分為非狹窄非穿透型35例、狹窄型32例，穿透型27例。另擇同期在金華市中心醫院體檢的106例健康體檢者作為對照組。CD組與對照組均排除哮喘、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化等自身免疫性疾病以及肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤病史。兩組受檢者性別、年齡、吸煙史比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1，且為無血緣關系的浙江漢族人群。本研究經金華市中心醫院醫學倫理委員會批準，受檢者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取受檢者外周靜脈血約3ml，乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2抗凝。用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取全基因組DNA。采用1%瓊脂糖電泳對所獲得的DNA樣本進行質量檢查及濃度檢測，然后根據檢測的濃度將樣本稀釋到工作濃度10ng/μl后置于-20℃冰箱凍存。

表1 兩組受檢者性別、年齡、吸煙史比較

1.2.2 改良多重高溫連接酶檢測反應（iMLDR）技術檢測IL-12B基因多態性（rs3212227和rs6887695）

1.2.2.1 多重PCR獲取目的基因片段 所需PCR擴增引物由上海生物工程技術有限公司合成。rs3212227上游引物：5′-GAAGGCCCATGGCAACTTGAG-3′，下游物：5′-CAATGTCACCCCACATCAACTTTTG-3′。rs6887695上游引物：5′-ACCCAGGGAAGGTGTGCTTCTC-3′，下游引物：5′-CACCCCTGAAGCGAGGTCAAAT-3′。總反應體系20μl，包含1×HotStarTaq緩沖液（大連寶生物工程有限公司），3.0mmol/L Mg2+（大連寶生物工程有限公司），0.3mmol/L dNTP（上海捷瑞生物工程有限公司），1U HotStarTaq聚合酶（德國Qiagen公司），1μl模板DNA和1μl多重PCR引物（引物濃度：rs3212227 1mmol/L，rs6887695 2mmol/L）。反應條件：95℃ 2min；94℃ 20s，65℃ 40s（每個循環減0.5℃），72℃ 1.5min，共11個循環；94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1.5min，共 24 個循環；72℃2min；置于 4℃保存。

1.2.2.2 多重PCR產物純化 在10μl PCR產物中加入5 U蝦堿性磷酸酶（SAP，美國Promega公司）和2U核酸外切酶（Exo I，美國Epicentre公司），37℃溫浴1h，然后75℃滅活15min。

1.2.2.3 iMLDR連接反應 連接反應體系包含10×連接緩沖液 1μl，純化后多重 PCR 產物 2μl，雙蒸水 6μl，高溫連 接 酶 0.25μl，5′連接 引物 混 合液（1μmol/L）0.4μl，3′連接引物混合液（2μmol/L）0.4μl，連接酶引物序列分別為 rs3212227:FG5′-TTCCGCGTTCGGACTGATATGCTGATTGTTTCAATGAGCATTTAGCAACG-3′；FP5′-AACTATACAAATACAGCAAAGATATCATTGTGATC-3′；FT5′-TACGGTTATTCGGGCTCCTGTGCTGATTGTTTCAATGAGCATTTAGCAGCT-3′。rs6887695:FC 5′-TGTTCGTGGGCCGGATTAGTCAGTTTGAGAGA－AGCAGTGTAGTGTAGTGTTC-3′;FG5′-TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTCAGTTTGAGAGAAGCAGTGTAGTGTAGTGTTG-3′;FP5′-AATAGTCTGGATTTACATCTTTGATCTTCCA-3′。連接反應條件：94℃ 1min，56℃ 4min，共38個循環；置于4℃保存。

1.2.2.4 基因型判讀 取0.5μl稀釋后的連接反應產物，與 9μl甲酰胺、0.5μl內標混勻，95℃變性 5min 后用ABI 3730XL測序儀（美國ABI公司）測序。最后采用GeneMapper 4.1軟件（美國ABI公司）判讀基因型。

1.3 觀察指標 觀察并比較兩組受檢者的IL-12B基因多態性；分析IL-12B基因連鎖不平衡關系和單倍型，以及IL-12B基因多態性與CD患者病變部位、疾病類型的關系。

1.4 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用χ2檢驗分析IL-12B 2個SNP位點（rs3212227和rs6887695）的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用logistic回歸分析比較兩組間IL-12B 2個SNP位點的等位基因和基因型頻率的分布差異，以及IL-12B基因多態性與CD病變部位、類型的相關性。采用Haploview 4.2軟件進行連鎖不平衡關系與單倍型分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者IL-12B基因多態性比較 對照組受檢者IL-12B rs3212227、rs6887695位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（均P＞0.05）。CD組患者與對照組受檢者IL-12B rs3212227、rs6887695位點的基因型與等位基因頻率比較均無統計學差異（均P＞0.05），見表2。

表2 兩組受檢者IL-12B基因多態性比較[頻次（%）]

2.2 IL-12B基因連鎖不平衡關系和單倍型分析 連鎖不平衡分析發現rs3212227和rs6887695 2個SNP位點之間存在中等強度的連鎖不平衡關系（D′=0.545，r2=0.235），見圖1。應用Haploview 4.2軟件共構建4種單倍型，在兩組受檢者間分析上述4種單倍型，結果發現各單倍型頻率在兩組間分布均無統計學差異（均P＞0.05），見表3。

圖1 IL-12B基因連鎖不平衡模式圖（方塊中數字代表2個SNP位點間的D′值；Block 1代表IL-12B基因各個SNP位點間存在連鎖不平衡）

表3 兩組受檢者IL-12B基因rs3212227、rs6887695位點4種單倍型比較[頻次（%）]

2.3 IL-12B基因多態性與CD病變部位、類型的關系采用非條件logistic回歸分析IL-12B基因rs3212227和rs6887695位點的等位基因和基因型頻率與CD病變部位的關系，結果發現IL-12B rs6887695位點的基因多態性與CD的病變部位有關（均P＜0.05）。與對照組相比，回腸型CD組患者rs6887695位點的C等位基因和GC+CC基因型頻率均明顯降低（28.75%vs 44.34%，P＜0.05，OR=0.507，95%CI:0.291～0.882；50.00%vs 71.70%，P＜0.05，OR=0.395，95%CI:0.186～0.836）；而 rs3212227和rs6887695位點的等位基因及基因型頻率分布在結腸病變CD組和對照組間比較均無統計學差異（均P＞0.05）。進一步CD組內分層比較發現，與結腸病變CD組比較，回腸型CD組患者rs6887695位點的C等位基因、GC+CC基因型以及CC基因型頻率亦均降低（28.75%vs 50.00%，P＜0.05，OR=0.404，95%CI:0.218～0.745；50.00%vs 72.22%，P＜0.05，OR=0.385，95%CI:0.163～0.908；7.50%vs 27.78%，P＜0.05，OR=0.150，95%CI:0.037～0.613），見表4。根據疾病行為進行分層分析，結果顯示IL-12B基因多態性與CD疾病類型無關（P ＞0.05），見表5。

表4 IL-12B基因多態性與CD病變部位的關系[頻次（%）]

表5 IL-12B基因多態性與CD疾病類型的關系[頻次（%）]

3 討論

IL-12B基因定位于第5號染色體5q31-33區域，全長15kb，包含8個外顯子，編碼相對分子量為40KD的細胞因子受體樣亞基p40。p40與IL-12A基因編碼的細胞因子受體樣亞基p35通過二硫鍵連接形成具有生物學活性IL-12。由于人類p35為組成性表達，而p40為調節性表達，因此IL-12B基因對IL-12的表達水平及生物學功能影響意義更大[13]。rs3212227和rs6887695是IL-12B的2個SNP位點，其中rs3212227位于3′非翻譯區（UTR）。研究表明該多態性位點可能影響IL-12B mRNA穩定性及IL-12蛋白表達水平[14]。來自健康人群的研究發現rs3212227位點純合子突變CC基因型攜帶者外周血單個核細胞活化后所表達的IL-12蛋白水平顯著高于AA基因型或AC基因攜帶者[14]。rs6887695位于IL-12B基因5′上游調控區域，有研究顯示該多態性位點可能影響轉錄因子 TSF1、MZF1、Oct-1、RORα 與DNA片段的親和力，因此是潛在的功能性位點[10]。迄今的研究已經證實IL-12B（rs3212227和rs6887695）基因多態性與哮喘[15]、銀屑病[16]、類風濕性關節炎[17]、Ⅱ型糖尿病[18]等多種免疫系統疾病相關。

本研究對照組受檢者IL-12B的突變等位基因G、C的頻率分別為49.53%、44.34%，與數據庫中千人基因組計劃所報道的中國南方人群的最小等位基因頻率（MAF）基本相符（rs3212227:47.4%，rs6887695:44.2%）。整體比較結果顯示，IL-12B 2個SNP位點（rs3212227和rs6887695）的等位基因和基因型頻率在對照組和CD組之間的分布均無統計學差異，表明IL-12B基因多態性與浙江漢族人群CD的易感性無關，這一結論與來自西班牙[19]、瑞典[20]以及新西蘭人群[21]的研究發現基本一致，而有學者報道盡管rs3212227多態性與CD易感性無關，但rs6887695突變后增加德國人群CD的發病風險[10]。在亞洲人群的研究中，日本學者在一項納入484例CD患者的研究結果中首次報道rs6887695純合子突變CC基因型攜帶者罹患CD的風險是其他基因型攜帶者的1.42倍[9]。本研究結果與日本人群及德國人群的研究報道相悖，推測可能與納入的樣本數量及種族遺傳背景差異有關。

目前認為，自身遺傳多態性與CD患者的疾病表型密切相關。例如Wu等[22]報道芳香烴受體（AhR）基因多態性與回腸型CD密切相關，而與病變累及結腸的CD無關。這一研究結果提示病變局限于回腸的CD和病變累及結腸的CD兩者的遺傳免疫學發病機制可能存在一定差異。本研究結果表明，rs6887695在對照組和回腸型CD組患者之間有統計學差異。回腸型CD患者中突變C等位基因以及GC+CC基因型頻率明顯低于對照組，提示rs6887695基因突變可能是浙江漢族回腸型CD的保護因素。此外，組內分層分析亦發現，回腸型CD組患者中rs6887695突變C等位基因和GC+CC基因型以及CC基因型頻率均低于結腸病變CD組患者，提示該位點基因突變可能導致CD患者更易累及結腸。國外學者亦曾探討IL-12B基因多態性與CD疾病部位的關系。Márque[19]等報道IL-12B基因rs3212227和rs6887695位點與西班牙人群CD病變部位及疾病行為均無關。而Ferguson等[21]報道rs6887695位點突變T等位基因是新西蘭小腸型CD的保護因素。另有研究表明rs3212227位點多態性可能與結腸型CD相關[10]。目前有關IL-12B基因多態性影響CD疾病部位的分子機制尚不明確。有研究發現盡管單核細胞分泌IL-12水平受其遺傳多態性影響，但外源性抗原激活單核細胞是促發IL-12表達的先決條件。有意思的是，IL-12B基因多態性對IL-12表達的影響只在某些特定的抗原如結核菌素、脂多糖誘導下呈現，而在其他抗原如葡萄球菌菌體蛋白誘導下，其基因多態性對IL-12表達無影響[14]，這表明IL-12B基因對IL-12表達的影響與環境菌群抗原種類密切相關。由于人類回、結腸中腸道菌群構成迥然各異，筆者推測IL-12B基因對CD病變部位的影響可能是其遺傳多態性和腸道菌群抗原差異等多方面因素綜合作用的結果。

綜上所述，本研究結果顯示IL-12B基因rs6887695位點多態性與浙江漢族人群CD的臨床表型可能相關，該位點的突變C等位基因、GC+CC基因型可能是回腸型CD的保護因素。由于體內IL-12信號所介導的炎癥反應和免疫應答錯綜復雜，本研究尚不能完全詮釋IL-12B對CD臨床表型影響的潛在機制，這有待于后續研究進一步探討。

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