沉默β-catenin表達對黑色素瘤A375細胞增殖與凋亡的影響研究

楊躍 曹毅 劉偉 楊曉紅

皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）多由痣或色素斑發展而來，一旦進入快速生長期，患者預后極差，平均生存期約30.3個月，且易發生轉移、復發。CMM在皮膚惡性腫瘤死亡病例中占80%[1]。現已證明，信號轉導通路在惡性黑色素瘤的發病機制中起至關重要的作用，提示干擾信號通路可能成為治療惡性黑色素瘤的新途徑[2]。Wnt/β-catenin是一條公認與腫瘤相關的信號通路，與腫瘤細胞的增殖、侵襲、凋亡等生物學行為均密切相關[3]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信號通路中關鍵的效應器，其在細胞內表達水平的高低可反映Wnt信號通路的活化狀態[4-5]。基于此，本研究旨在通過干擾慢病毒沉默黑色素瘤A375細胞中β-catenin蛋白的表達，探討β-catenin蛋白對A375細胞增殖與凋亡的影響，以期為臨床研制惡性黑色素瘤的治療藥物提供參考，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞 人惡性黑色素瘤A375細胞（以下簡稱A375細胞），購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑 鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體（美國abcam公司）；羊抗兔IgGHRP、羊抗鼠IgG-HRP（北京中杉金橋生物技術有限公司）；MTT、FBS、胰酶（美國 Gibco公司）；二甲基亞砜（北京Solarbio公司）；細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物有限公司）；DMEM細胞培養基（北京全式金公司）。

1.3 主要儀器 自動酶標儀（芬蘭雷勃公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；蛋白電泳裝置（美國BD公司）；細胞恒溫培養箱（日本SANYO公司）。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養 A375細胞使用DMEM完全培養基常規培養，培養條件：5%二氧化碳、37℃恒溫。細胞傳代3次后用于實驗。

1.4.2 慢病毒載體siRNA制作 慢病毒載體siRNA構建由上海吉瑪公司負責包裝。干擾β-catenin靶基因CTNNB 1 mRNA siRNA β-catenin-RNAi-LV 干擾序列：5′-GGATGTGGATACCTCCCAAGT-3′，并提供對應的慢病毒對照β-catenin-negative-LV，序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4.3 慢病毒感染A375細胞 將A375細胞進行常規消化、離心、重懸后計數，將細胞懸液稀釋至1×104/ml。將細胞接種于6孔板中，每孔2×104個，體積2ml。顯微鏡下觀察細胞融合度約為30%～40%時，分別往對應的孔內加入病毒液3μl，8h后觀察細胞狀態，并給細胞換液，4d后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞熒光染色情況。經β-catenin-RNAi感染的A375細胞記作A375-RNAi細胞；經β-catenin-negative感染的A375細胞記作A375-negative細胞，作為陰性對照；未經任何病毒感染的A375細胞作為空白對照。當轉染效率＞70%時，細胞分別繼續傳代、培養。

1.4.4 Western blot法檢測細胞β-catenin表達水平常規細胞總蛋白提取后，進行蛋白電泳，轉膜（200mA，90min），將NC膜在脫脂奶粉封閉1h，在一抗溶液中4℃過夜，TBST清洗3遍，將NC膜放入1∶2 500配置好的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗中室溫下孵育1h。TBST清洗3遍，曝光，膠片晾干，掃描后應用Image J軟件分析不同細胞中β-catenin蛋白表達水平的差異。

1.4.5 MTT法檢測細胞增殖活性 分別將3組細胞制成0.75×104/ml的細胞懸液，接種于 96孔板，200μl/孔，培養24h，加入20μl/孔MTT工作溶液，4h后終止培養，加入150μl DMSO/孔，低速振蕩10min，用酶聯免疫檢測儀測量各孔的吸光度值，48、72h后分別取出一塊96孔板，按相同的步驟測量各孔的吸光度值并記錄，吸光度值越大代表增殖活性越強。以上實驗重復3次。

1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 分別將3組細胞消化、離心，用適量1×Buffer A重懸，制成1×106/ml的細胞懸液，加乙醇，于-20℃固定16h；1×Buffer A洗細胞2次，用0.25mg/ml RNaseA重懸，37℃作用30min；加PI 5μl，室溫避光染色30 min；流式細胞儀激發波長488nm檢測細胞凋亡率。

1.5 觀察指標 觀察并比較A375、A375-RNAi、A375-negative細胞倒置熒光顯微鏡下所見、β-catenin表達水平、增殖活性及凋亡率。

1.6 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件；計量資料以表示，3組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A375、A375-RNAi、A375-negative 細胞倒置熒光顯微鏡下所見比較 A375-RNAi細胞倒置熒光顯微鏡下見帶綠色熒光，A375-negative細胞見帶綠色熒光，未經任何病毒感染的A375細胞無熒光，說明A375-RNAi、A375-negative細胞慢病毒感染成功。

2.2 A375、A375-RNAi、A375-negative 細胞 β-catenin表達水平比較 見圖1。

由圖1 可見，A375、A375-RNAi、A375-negative 細胞β-catenin表達水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。A375-RNAi細胞β-catenin表達水平較A375細胞與A375-negative細胞明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。A375細胞與A375-negative細胞β-catenin表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），β-catenin在A375細胞中高表達，β-catenin在A375-RNAi細胞中的表達量下降約55.1%，即β-catenin被干擾慢病毒液有效沉默。

2.3 A375、A375-RNAi、A375-negative 細胞增殖活性比較 見表1。

由 表1 可見 ，24、48、72h 時 ，A375、A375-RNAi、A375-negative細胞增殖活性比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。A375-RNAi細胞增殖活性較A375-negative細胞與A375細胞減弱（均P＜0.05），A375-negative細胞與A375細胞增殖活性比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 A375、A375-RNAi、A375-negative細胞 β-catenin 表達水平比較（a：蛋白電泳圖比較；b：表達水平比較；與A375-negative細胞比較，*P＜0.05）

表1 A375、A375-RNAi、A375-negative 細胞增殖活性比較

2.4 A375、A375-RNAi、A375-negative 細胞凋亡率比較 見圖2。

圖2 A375、A375-RNAi、A375-negative細胞凋亡率比較（與 A375-negative 細胞比較，*P＜0.05）

由圖2 可見，A375、A375-RNAi、A375-negative細胞凋亡率比較差異有統計學意義（P＞0.05）。A375-RNAi細胞凋亡率較A375-negative細胞與A375細胞明顯增高（均P＜0.05)；A375-negative細胞與A375細胞凋亡率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A375-RNAi細胞凋亡率為（21.17±3.41）%。

3 討論

惡性黑色素瘤是一種發展迅速、高侵襲性、易轉移、易復發的腫瘤，現已成為皮膚常見惡性腫瘤之一。因患者對皮膚腫瘤重視程度不夠，確診時多屬于中晚期，這也成為CMM預后極差、病死率極高的原因之一。

信號轉導通路可揭示腫瘤發生、發展的分子機制。經典Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發育和細胞內環境穩定，調控細增殖、分化及干細胞、祖細胞自我更新中起重要作用[6]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵蛋白，它通過與酪蛋白激酶1α（CK1α）、糖原合成酶激酶 3（GSK 3）、腺瘤性結腸息肉病（APC）和軸蛋白（Axin）形成的降解復合體結合，使β-catenin磷酸化并降解[7-8]。β-catenin蛋白在細胞內異常聚集或高表達會持續激活Wnt信號[9]，可能使得信號通路中的其他分子發生突變，從而促進腫瘤的發展[10]。

RNAi技術能特異性剔除或關閉特定基因的表達以達到沉默靶基因目的，已成為一種功能非常強大的工具[8]。本實驗所使用的慢病毒載體攜帶有綠色熒光蛋白基因，轉染成功后在宿主細胞內顯示綠色熒光；并能將靶基因片段融合至宿主基因內，能穩定的傳遞給子代細胞。通過觀察帶綠色熒光細胞比例及Western blot分析轉染效率。結果顯示，在倒置熒光顯微鏡下，A375-RNAi、A375-negative 細胞見帶綠色熒光，A375-RNAi、A375-negative細胞慢病毒感染成功；Western blot顯示A375-RNAi細胞內β-catenin的表達水平下調約55.1%，而A375-negative細胞無明顯下調。這可以說明本實驗運用慢病毒干擾成功沉默了β-catenin的表達。

Sinnberg等[11]利用 β-catenin干擾劑 PKF115-584作用于正常黑色素細胞和原位惡性黑色素瘤細胞WM35、WM115、WM793及轉移性惡性黑色素瘤細胞451LU、SkMel28、1205LU、Mewo，結果顯示：上述所有細胞在PKF115-584作用3d后細胞存活率均下降，并隨PKF115-584濃度升高，細胞存活率下降。緊接著，Sinnberg等[11]又用慢病毒載體介導shRNA轉染上述所有細胞，沉默β-catenin表達。在感染慢病毒2d后，檢測細胞增殖情況，發現所有細胞增殖活性降低，且隨感染時間延長，細胞存活率逐漸減低。此研究證實，無論是從干擾β-catenin表達還是阻斷β-catenin轉錄活性，均會對惡性黑色素瘤細胞增殖起到抑制作用。

細胞凋亡過程主要受Bcl-2蛋白家族的蛋白調控。現已證實，Bcl-2基因是一個典型的原癌基因，在Bcl-2蛋白家族中，參與凋亡作用的主要是Bcl-2、Bax及Bak[12]。Bcl-2能通過阻斷Bax和Bak活化而阻止細胞應對各種變化導致的凋亡。即Bax蛋白能促進細胞凋亡，而Bcl-2卻能負調控細胞凋亡。研究發現，β-catenin作為轉錄因子能夠調控Bax及Bcl-2蛋白的表達而參與凋亡過程[13]。c-Myc是一個公認的原癌基因，已經被證實是β-catenin的靶基因之一。c-Myc作為轉錄因子，是細胞內最重要轉錄因子之一，通過激活或抑制基因轉錄，最終能影響細胞增殖與凋亡，當缺乏營養劑生長刺激的情況下，c-Myc蛋白過表達，誘導細胞凋亡[14]。

綜上所述，β-catenin轉錄活性提高是伴隨惡性黑色素瘤發展，并可作為黑色素瘤細胞生存的標志之一。抑制β-catenin表達或活性可抑制細胞增殖、誘導抗凋亡基因下調，促進細胞凋亡，但其具體的作用機制有待于進一步的研究。

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