血漿miRNA-486-5p作為口腔鱗癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物的臨床研究

王璇 閆妍 高山 孫正

口腔癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第六位，口腔癌中90%為鱗狀細胞癌，預(yù)后差、易復(fù)發(fā)、具有明確的癌前損害[1-3]。目前缺少客觀的、有效的、微創(chuàng)的監(jiān)測手段。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約為20-24個核苷酸的小RNA，其在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[4,5]。MiRNA表達譜有腫瘤特異性及組織特異性，在口腔癌前病損、鱗癌組織及腫瘤細胞內(nèi)均可檢測到某些異常表達的miRNA。在各種體液中，如血漿、血清、尿液和唾液等，無細胞miRNA可以作為癌癥的微創(chuàng)診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[6]。本研究擬采用高通量測序方法對口腔鱗癌患者術(shù)前1周內(nèi)及術(shù)后一年血漿miRNA表達水平進行研究，篩選出能夠反應(yīng)腫瘤復(fù)發(fā)狀況的miRNA；并采用qRT-PCR對篩選出的指標(biāo)進行驗證,以期發(fā)現(xiàn)能夠反應(yīng)腫瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)記物。

1.材料與方法

1.1 病例選擇 選擇外科病房口腔鱗癌患者28例，其中男19例，女9例，年齡44-90歲，平均64.32歲。門診招募健康對照者21例，男6例，女15例，年齡37-73歲，平均54.05歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床及病理診斷口腔鱗狀細胞癌的患者納入實驗組，口腔健康者納入對照組；(2)年齡18-90歲，無免疫系統(tǒng)疾病及HIV感染；(3)未經(jīng)激光，放射線或化學(xué)等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18歲以下或90歲以上者；(2)妊娠或哺乳期婦女；(3)有嚴(yán)重心、肺、肝、腎等系統(tǒng)性疾病者；(4)其他腫瘤、精神病患者；(5)有免疫系統(tǒng)疾病或HIV感染者；(6)已經(jīng)激光，放射線或化學(xué)等治療。所有受試者知情同意。其中，有8例在術(shù)后一年隨訪時有腫瘤復(fù)發(fā)，20例術(shù)后一年無復(fù)發(fā)。

1.2 標(biāo)本采集及處理 所有受試者均空腹用EDTA抗凝采血管采取靜脈血5ml，口腔鱗癌患者術(shù)前(PB)一周內(nèi)及術(shù)后(PA)一年復(fù)查時采集兩次，健康對照者(PH)采集一次。4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，離心5min，取上清于EP管中凍存于-80℃。

1.3 目標(biāo)miRNA篩選 取8例鱗癌(術(shù)后1年復(fù)查無復(fù)發(fā))術(shù)前及術(shù)后血漿樣本和3例健康對照組血漿樣本5μl用Illumina公司的Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kit構(gòu)建小RNA文庫，使用2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip(Agilent)對純化的cDNA文庫進行確證及定量，并使用KAPA Library Quantification Kit(KAPA biosystems)進行濃度定量。使用Illumina HiSeq 2000對cDNA文庫進行測序(由北京基因組研究所完成)。測序結(jié)果使用FASTX-Toolkit去除低質(zhì)量讀段后使用Bowtie與人miRNA、其他小RNA(piRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及Y RNA)、長鏈RNA(r RNA、lincRNA、R fam及mRNA)及人類口腔微生物組成分進行比對，并對表達量高的前100種miRNAs進行主成分分析，對miRNA表達量標(biāo)準(zhǔn)化后篩選出在口腔鱗癌術(shù)前、后及健康對照組之間存在明顯表達差異的miRNAs。某miRNA標(biāo)準(zhǔn)化表達=(該miRNA計數(shù)/所有miRNAs計數(shù))×106。

1.4 血漿miR-486-5p的qRT-PCR驗證 取剩余20例鱗癌(其中12例術(shù)后一年無復(fù)發(fā)，8例術(shù)后一年復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)者手術(shù)前取血漿)術(shù)前及術(shù)后復(fù)查時血漿樣本和18例健康對照組血漿樣本各200μl進行 PCR驗證。首先加入 60μl的 TRIzol LS Reagent試劑提取血漿RNA，并加入1.5μl spikein(Qiagen)，使用cDNA Synthesis kit II(Exiqon)進行反轉(zhuǎn)錄，將所得的cDNA樣品加入到含有miRNA-486-5p引物的Pick-&-Mix microRNA PCR Panels(Exiqon)。將準(zhǔn)備好的PCR板置于Realtime PCR儀上進行PCR反應(yīng)。所有的指標(biāo)均設(shè)置3次重復(fù)，并按以下程序進行：95℃10min；共40個PCR循環(huán)(95℃10s，60℃60s，熒光檢測1次)。miRNA-486-5p表達值根據(jù)內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化。某miRNA相對表達量=2-⊿CT(⊿CT=CTsample-CTspike-in)。

1.5 GO分析 利用DAVID在線工具[7]對miR-486-5p靶基因進行GO分析，獲知其參與的生物學(xué)過程。

1.6 統(tǒng)計處理 如方差齊性，術(shù)前與術(shù)后結(jié)果進行配對t檢驗，術(shù)前與健康組、術(shù)后與健康組均進行成組t檢驗，如方差不齊，則采用秩和檢驗。根據(jù)觀察期內(nèi)腫瘤有無復(fù)發(fā)將口腔鱗癌病例分為復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組，并將兩組分別進行組內(nèi)和組間比較。以雙尾α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 高通量測序結(jié)果 在去除低質(zhì)量讀段及連接體序列后，清晰讀段的產(chǎn)量平均為5.15×106(范圍從2.83×106到8.47×106)(見表1)。所有樣本的長度分布分析顯示：在我們預(yù)期的20-24nt處出現(xiàn)峰值，該長度符合miRNAs的大小。除此之外，在27nt及31-33nt處也出現(xiàn)了峰值(如圖1A)。對所有樣本的注釋分析顯示：40%的清晰讀段被注釋為人類小RNA，35%符合Y RNAs片段，約9%符合mRNA(見圖1B)。在我們的測序數(shù)據(jù)中Y RNA片段主要來源于可與人類基因組GRCh37/hg19染色體3:156,871,337-156,871,429配對的Y4的5′末端，這些片段使得長度分布在27nt及31-33nt處出現(xiàn)了波峰寬度增加(見圖1A)。

表1 血漿樣本測序數(shù)據(jù)分析注釋

圖1 血漿小RNAs高通量測序結(jié)果長度分布及注釋分析

所有樣本的比對及注釋分析顯示：在本研究的三組樣本(PB、PA、PH)中，比對出已知的人類miRNAs分別為1156,1066及810種，其中大部分(745種)miRNAs在三組樣本中均有出現(xiàn)，而分別有161,81及11種為每組中特異性出現(xiàn)的，且均為低表達量(RPM＜50)，提示我們這些小RNA具有有限的生物學(xué)意義。因此，我們選取的目標(biāo)小RNA為在所有標(biāo)本中均有表達者，按照表達量由高到低進行排序，前10種見表2。MiRNA-486-5p表達量最高，占所有miRNAs讀段的39.6%(PH組為53.0%，PA組為44.8%，PB組為21.3%)，且存在差異性表達(表3)。

表2 血漿測序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果排序(前10種，按表達量由高到低排列)

表3 miRNA-486-5p血漿高通量測序結(jié)果的組間比較

2.2 PCR驗證結(jié)果 各組miRNA-486-5p表達量見表4。在20名OSCC受試者中有16名在術(shù)后較術(shù)前表達升高，且此種改變有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同時，這種表達水平的升高也體現(xiàn)在健康對照組與腫瘤術(shù)前組的比較中(P＜0.05)。為進一步研究，我們將腫瘤術(shù)后組與健康對照組進行了比較，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，這意味著外科手術(shù)后miRNA-486-5p表達水平表達得到了恢復(fù)。

表4 miRNA-486-5p在各組中的表達量

按照腫瘤有無復(fù)發(fā)將患者分為有復(fù)發(fā)及無復(fù)發(fā)兩組，將腫瘤術(shù)前(PB)與健康對照(PH)血漿miRNA-486-5p表達水平進行比較，有復(fù)發(fā)組及無復(fù)發(fā)組均表達降低，且此種改變均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

將腫瘤術(shù)后(PA)與術(shù)前(PB)血漿 miRNA-486-5p表達水平進行比較，在無復(fù)發(fā)的12名患者中，有11名出現(xiàn)miRNA-486-5p表達升高，且此種改變有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。在腫瘤復(fù)發(fā)的8名患者中，僅有3名患者出現(xiàn)表達升高，且此種改變無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

將腫瘤術(shù)后(PA)與健康對照(PH)組血漿miRNA-486-5p表達水平進行比較，復(fù)發(fā)組及無復(fù)發(fā)組均未出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的改變。

2.3 GO分析結(jié)果 對miRNA-486-5p進行了GO分析，結(jié)果如下：從圖2中可以發(fā)現(xiàn)miRNA-486-5p參與許多生物過程，如程序性細胞死亡、細胞凋亡、細胞周期等。尤其是miRNA-486-5p參與包括凋亡的正調(diào)節(jié)和程序性細胞死亡，這與其在口腔鱗癌患者血漿中的表達下調(diào)相匹配。

圖2 miR-486-5p靶基因功能注釋圖

3.討論

本研究中，我們選擇了8例無復(fù)發(fā)口腔鱗癌患者作為研究對象，分別于術(shù)前1周內(nèi)及術(shù)后一年復(fù)查時收集血漿標(biāo)本，同時收集健康人的血漿標(biāo)本，進行高通量測序，旨在篩選血漿中miRNA生物標(biāo)志物用于診斷口腔鱗癌及對鱗癌患者手術(shù)后的預(yù)后判斷。在術(shù)前和術(shù)后配對的口腔鱗癌患者血漿和健康對照血漿中，使用高通量測序方法分析血漿中的循環(huán)小RNA。查閱相關(guān)文獻，本研究是第一次使用高通量測序技術(shù)對口腔鱗癌中配對的術(shù)前和術(shù)后血漿樣品中的小RNA進行測序分析，并用于檢測癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)的miRNA的報告，目前未見其他文獻報道。測序結(jié)果顯示，口腔鱗癌術(shù)前血漿中miRNA-486-5p的表達水平較健康對照者明顯下調(diào)，術(shù)后又回升到正常水平。

為了避免重復(fù)，我們使用不同的病例集進行了PCR驗證，包括12例鱗癌無復(fù)發(fā)者、8例有復(fù)發(fā)者和18例健康對照者，并據(jù)此分層分組，對血漿中miRNA-486-5p的表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)鱗癌術(shù)前組和術(shù)后復(fù)發(fā)組的血漿miRNA-486-5p表達是降低的，而鱗癌術(shù)后無復(fù)發(fā)組血漿miRNA-486-5p的表達是升高的。這提示對于有過鱗癌病史的人群，miRNA-486-5p的降低可能標(biāo)志著鱗癌的復(fù)發(fā)。

我們血漿樣品中表達最豐富的miRNA是miRNA-486-5p，占所有miRNA讀段總數(shù)的39.6%，在以前的研究文獻中也顯示了血漿中miRNA-486-5p較高的豐度[8]，與本研究的結(jié)果一致。它從錨蛋白1(一種在紅細胞前體，內(nèi)皮細胞和骨骼肌中表達的基因)轉(zhuǎn)錄而來，因此我們在血漿中檢測到高表達的miRNA-486-5p是不足為奇的。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)：我們檢測到的非常高的miRNA-486-5p表達也可能是由用于本研究的文庫制備試劑盒(Illumina TruSeq小RNA文庫制備試劑盒)引起的。該試劑盒已報道產(chǎn)生高于預(yù)期的miRNA-486-5p的表達[9]。然而，qRT-PCR驗證高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-486-5p可作為口腔鱗癌的潛在診斷生物標(biāo)志物，因為其在口腔鱗癌術(shù)前血漿(PB)和健康對照血漿(PH)比較中，在PB組中表達明顯下降。此外，miRNA-486-5p與OSCC復(fù)發(fā)高度相關(guān)，在觀察期內(nèi)，術(shù)前組(PB)與術(shù)后血漿(PA)相比，口腔鱗癌復(fù)發(fā)的患者miRNA-486-5p的表達失調(diào)現(xiàn)象不顯著。然而，在沒有OSCC復(fù)發(fā)的患者組中，術(shù)前miRNA-486-5p的表達是顯著下調(diào)的。因此，患者手術(shù)前后miRNA-486-5p的表達改變可作為生物標(biāo)志物來監(jiān)測手術(shù)后口腔鱗癌的復(fù)發(fā)。文獻顯示，也已經(jīng)在其他類型的腫瘤中檢測到miRNA-486-5p的下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-486-5p在乳腺癌組織和細胞系中被抑制，并通過直接靶向癌基因PIM-1作為腫瘤抑制性miRNA[10]。在肺癌中，miRNA-486-5p通過下調(diào)調(diào)節(jié)腫瘤性ARHGAP5和胰島素生長因子信號傳導(dǎo)被鑒定為腫瘤抑制因子，其下調(diào)在血漿樣品中也得到驗證[11-13]。在胃癌中，在組織和細胞系中證實了miRNA-486-5p的調(diào)節(jié)，并且確定了OLFM4作為其靶標(biāo)[14]。已經(jīng)報道[15]認為，miRNA在腫瘤中的特異性表達使其可以成為腫瘤的標(biāo)志物，并用于對腫瘤的診斷和評價預(yù)后。miRNA-486-5p在口腔鱗癌組織中表達下調(diào)[16]，但未見關(guān)于循環(huán)miRNA-486-5p在口腔癌中表達失調(diào)的報道。我們的研究也是第一次使用miRNA-486-5p作為口腔鱗癌復(fù)發(fā)的潛在循環(huán)生物標(biāo)志物的報告。

綜上所述，miRNA-486-5p有潛力作為口腔鱗癌診斷的候選生物標(biāo)志物，可用于手術(shù)后監(jiān)測口腔鱗癌復(fù)發(fā)的標(biāo)記物。但在這項研究中，一方面，用于測序和qRT-PCR驗證的血漿樣品的數(shù)量是有限的；另一方面，少數(shù)病例血漿miRNA-486-5p的失調(diào)趨勢不明確，因此，在這里發(fā)現(xiàn)的潛在miRNA生物標(biāo)志物應(yīng)該在大規(guī)模篩選中進一步驗證以證實這些發(fā)現(xiàn)。

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