玉米皮纖維發酵裂褶菌的產酶分析及木聚糖酶基因克隆、表達和酶學性質測定

王靖宇，劉玉春，韓偉，莊緒會，李曉敏，陳新，張曉琳*

1(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢，430023) 2(國家糧食局科學研究院，北京， 100037)

我國玉米淀粉年產量在2 300萬t左右，玉米皮作為玉米淀粉生產的副產品，占玉米籽粒質量的15%左右[1]。玉米皮中半纖維素含量較高，約為73.2%～86.0%，蛋白質為5.0%～11.5%，淀粉為4.0%～11.2%[2]。玉米皮半纖維素是由β-1,4糖苷鍵連接的木聚糖主鏈及包括L-阿拉伯糖、D-半乳糖、葡萄糖醛酸、阿魏酸等側鏈殘基構成[2]。因此，玉米皮的降解利用需要多種酶參與，如木聚糖酶(xylanase)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)、乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterase)、α-葡萄糖醛酸苷酶(α-glucuronidase)等。

木聚糖酶(1,4-β-D-xylanase; EC3.2.1.8)是目前研究最為廣泛的半纖維素酶，也是一種重要的工業用酶，在食品、飼料、酶法生產功能性低聚木糖工業等方面都起到重要的作用[3-5]。木聚糖酶在糧食加工和糧油加工副產物增值利用發面有重要的應用價值，但目前關于木聚糖酶應用于糧食加工副產物玉米皮的研究較少，大多數木聚糖酶仍很難滿足工業上的要求，因此需要挖掘新的木聚糖酶基因資源。

裂褶菌(Schizophyllumcommune)隸屬于真菌門(Eumy cophy ta)，擔子菌綱(Basidiomycetes)，傘菌目(Agaricales)，裂褶菌科(Schizophy llaceae)，裂褶菌屬(Schizophyllum)，又稱白參、樹花、八擔柴，具有較強的半纖維素和纖維素的分解能力，在含有半纖維素和木質素的基質上生長良好[6]。此外，裂褶菌是一種十分重要的食藥兼用真菌，含有豐富的生理活性物質，其發酵產物作為極有開發前景的生物活性物質已得到國內外的普遍重視。

本研究設計應用玉米皮纖維發酵培養裂褶菌，測定了玉米皮纖維的發酵液中半纖維素酶活性、產酶歷程和發酵液水解不同底物的酶活力；根據酶活測定結果和目前已有基因組序列信息，克隆表達了裂褶菌木聚糖酶Xyn22，并完成了酶學性質測定，為玉米加工副產物玉米皮的增值轉化和資源化利用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

SchizophyllumcommuneDB01為由本實驗室篩選并保存菌株。大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)、大腸桿菌E.coliTop10為本實驗室保存，以及質粒pET-28a(+)均為本室保存。

1.1.2 主要試劑

α-葡萄糖醛酸苷酶試劑盒：Magazine公司；α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、對硝基苯酚：北京索萊寶科技有限公司；石油醚：國藥集團；對硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷、對硝基苯酚醋酸酯、樺木木聚糖、D-(+)-木糖：Sigma公司；3,5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；β-燕麥葡聚糖、魔芋膠、瓜爾豆膠：上海源葉生物科技有限公司。限制性酶、質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒以及膠回收試劑盒等購自生工生物工程(上海)有限公司；RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)、反轉錄試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit)購自Roch公司；生物素、胰蛋白胨和酵母抽提物等購于OXOID公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器

水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；6110分析天平，Tecator公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱，蘇州培英實驗設備有限公司；PCR儀，美國伯樂公司；酶標儀，美國BioTek公司；DHP-9272型電熱恒溫培養箱，上海恒科科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米皮纖維的提取

提取步驟：玉米皮→干燥→超微粉碎→脫脂→離心分離→加水制成懸液→α-淀粉酶酶解→糖化酶酶解→蛋白酶酶解→離心分離→沉淀(玉米皮纖維)

脫脂：有機溶劑(石油醚)浸提去除玉米皮脂肪。

將干燥后的玉米皮進行超微粉碎，粉碎后過60目篩；取100 g玉米皮，按1∶13(g∶mL)的固液比加入蒸餾水，調節pH值為6.0，向體系中加入耐高溫α-淀粉酶，95 ℃水浴下處理30 min，降低水浴溫度為55 ℃，加入糖化酶，反應30 min，并利用I2-KI溶液檢查淀粉水解情況。向上述處理處理液中加入中性蛋白酶，在水浴溫度55 ℃，pH為7.0的條件下，反應60 min后，加熱至100 ℃滅酶5 min，紗布過濾，濾渣用蒸餾水洗滌2遍，105 ℃烘干后備用。

1.2.2 培養條件

玉米皮纖維培養基：

碳源：10 g/L玉米皮纖維;氮源：1 g/L蛋白胨，0.2 g/L尿素；無機鹽：4.2 g/L (NH4)2SO4、2 g/L KH2PO4、 0.3 g/L CaCl2、0.3 g/L MgSO4·H2O、2 mL微量元素(5 g/L FeSO4·7H2O，1.6 g/L MnSO4·4H2O，1.4 g/L ZnSO4·7H2O，2 g/ L CoCl2)；其他：2 g/L Tween 80。

將目標菌株接種于300 mL玉米皮培養基中，30 ℃、220 r/min培養7d。在培養過程中，每24 h取1次樣，取樣過程中盡量避免振蕩，將發酵液于12 000 r/min離心15 min，取上清液。

1.2.3 發酵液半纖維素酶活測定方法

1.2.3.1 木聚糖酶活性測定

使用3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)法[7]：取900 μL 10 mg/mL底物(櫸木木聚糖)在37 ℃預熱后，加入100 μL適當稀釋的酶液，在37 ℃反應10 min，然后加1.5 mL DNS試劑終止反應，沸水煮5 min并冷卻至室溫后，在540 nm波長下測定釋放出的還原糖。同時設一對照，在加入酶液前先加入1.5 mL DNS試劑終止反應。1個酶活單位(U)定義為每分鐘分解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量。

1.2.3.2 乙酰木聚糖酯酶活性測定

以對硝基苯酚醋酸酯為底物，用分光光度法測定裂褶菌發酵產乙酰木聚糖酯酶活力[8]：取0.04 mL 100 mmol/L 的底物(DMSO溶解)與0.86 mL 100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)混勻，加入0.1 mL適當稀釋的發酵液液，37 ℃下準確反應10 min后加入3 mL甲醇終止反應，再加入2 mL去離子水，測定410 nm波長下吸光度。1個酶活性單位(U)定義為每分鐘產生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.2.3.3 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性測定

采用酶水解對硝基苯-阿拉伯呋喃糖苷(pNPAF)釋放對硝基苯酚(pNP)的量確定。pNPAF終濃度為2 mmol/L，酶液為5 μL，37 ℃反應10 min后加人100 μL 1mol/L Na2CO3終止反應，測定410 nm下的吸光值[9]。1個酶活性單位(U)定義為每分鐘產生1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量。

2．王右軍宅所在地的特征。(1)丹池山，“池有水赤色，勺之潔白”，這一特征是后人難以偽造的；(2)池“禱雨甚靈”，新嵊當地百姓對干旱之年可求雨的地方都稱之為龍潭；(3)南為刻石山，有石可刻；(4)南山之半有巨井，井有蛟；(5)山北有小香爐峰；(6)王右軍出入需經過再渡村。

1.2.3.4 α-葡萄糖醛酸苷酶

根據試劑盒說明書操作。

1.2.4 裂褶菌木聚糖酶基因Xyn22的克隆與表達

1.2.4.1 大腸桿菌工程菌的構建

1.2.4.2 重組酶的誘導表達與純化

連接好的重組質粒電激轉化到大腸桿菌感受態細胞E.coliBL21(DE3)。轉化后涂在含100 μg/mL卡那霉素(Kana)的LB平板上，37 ℃過夜培養后，挑取菌落進行PCR驗證。取含有重組質粒pET-Xyn22的E.coliBL21(DE3)菌株和只含有pET-28a(+)空質粒的E.coliBL21(DE3)菌株，以0.1%的接種量接種于LB(含100 μg/mL Kana)培養液中，37 ℃快速振蕩16 h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB(含100 μg/mL Kana)培養液中振蕩培養至OD600值達到0.6～1.0后，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導。于30 ℃繼續振蕩培養約8 h后離心收集菌體，超聲破碎，Ni-親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測等，均采用實驗室常規方法[11]。

酶的最適pH的測定：在重組酶比較穩定的溫度(一般為37 ℃)下，將酶促反應置于pH 2.0～10.0的緩沖液中進行(Gly-HCl：2.0～3.5；Na2HPO4-Citrate：3.0～8.0；Na2HPO4-NaH2PO4：6.0～8.0；Tris-HCl：7.5～9.0；Gly-NaOH：9.0～10.0)。酶的pH穩定性測定：將純化的酶液置于pH 2.0～13.0的緩沖液中(Gly-HCl：2.0～3.5；Na2HPO4-Citrate：3.0～8.0；Tris～HCl：7.5～9.0；Gly-NaOH：9.0～10.5；Na2HPO4-NaOH：10.5～12.5；KCl-NaOH：12.5～13.0)，在重組酶比較穩定的溫度(一般37 ℃)下處理1 h以上，然后在最適pH及重組酶比較穩定的溫度(一般37 ℃)下進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。

1.2.4.4 最適溫度和溫度穩定性的測定

酶的最適溫度測定：在最適pH的緩沖液中，于25～80 ℃下進行酶促反應。酶的熱穩定性測定：將同樣酶量的酶液置于不同的溫度中處理0～120 min后，在最適pH及最適溫度下進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。

1.2.4.5 金屬離子和相關化學試劑對酶活的影響

酶的金屬離子及化學試劑抗性：在反應體系中加入終濃度為5 mmol/L的金屬離子及化學試劑，在最適pH及最適溫度下進行酶促反應，以未加金屬離子及化學試劑的酶液作為對照。

1.2.4.6 水解木聚糖產物分析

木聚糖酶降解底物的產物分析：在37 ℃及最適pH條件下，用純化酶液降解100 μL 10 mg/mL的樺木木聚糖1 h，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖作為標準，應用薄層層析分析水解產物。

2 結果與分析

2.1 裂褶菌發酵玉米皮纖維

裂褶菌在以玉米皮纖維為唯一碳源的培養基中生長良好，顯示該菌株能夠有效降解，利用玉米皮纖維，將玉米皮纖維轉化為其菌體生長所必須的碳源。7 d培養結果顯示，培養基由未接菌時的渾濁變為澄清，裂褶菌生長形成大量球狀菌絲體，如圖1。半纖維素的充分降解需要木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸苷酶等多種酶共同作用，因此結果顯示裂褶菌能夠通過表達、分泌多種酶水解玉米皮纖維。

A-玉米皮纖維培養基；B-發酵培養后菌體生長狀態圖1 玉米皮纖維發酵裂褶菌Fig.1 Fermentation culture of Schizophyllum commune DB01 with corn bran fiber

2.2 發酵液半纖維素酶活測定

玉米皮纖維主要由半纖維素組成，因此測定了發酵液中半纖維素主鏈降解酶木聚糖酶的活性；側鏈降解酶乙酰木聚糖酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶的活性(表1)。

表1 裂褶菌發酵玉米皮纖維產酶分析Table 1 Analysis of enzyme production of corn bran fibersfermented by S.commune DB01

當培養至第5天時，發酵液中木聚糖酶活力基本穩定，當培養至第6天時酶活達到最高，為7.45 U/mL。發酵液側鏈降解酶，乙酰木聚糖酶在培養至第6天時酶活力達到最高，為3.41 U/mL。發酵液中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力在培養初期活達到最高，但培養1～4 d酶活呈下降趨勢，在第5天后基本穩定，最高酶活為0.44 U/mL。α-葡萄糖醛酸苷酶活力也在培養初期達到最高酶活，在之后6天酶活基本穩定，且酶活相對較低最高酶活為0.074 U/mL(表1)。

2.3 裂褶菌木聚糖酶的誘導表達與純化

裂褶菌木聚糖酶基因Xyn22全長687 bp，編碼228個氨基酸和一個終止密碼子。BLASTp結果表明,Xyn22與S.communeH4-8來源的11家族木聚糖酶蛋白(XP_003038466.1)具有最高的一致性為100%，該木聚糖酶目前還沒有酶學性質的研究報道。根據Xyn22核酸序列設計合成表達引物，并用表達引物PCR擴增Xyn22基因全長，PCR產物經純化、酶切后連接入pET-28a(+)載體，轉化E.coliBL21(DE3)進行原核表達。將收集的菌體超聲破碎后經Ni2+-NTA親和層析純化。SDS-PAGE電泳表明純化的酶液達到了電泳純(圖2)，分子質量為24.1 kDa，與理論分子量相近。

M-低分子量蛋白標準；1-細胞破碎液上清；2-純化重組蛋白圖2 Ni2+-NTA親和層析純化重組木聚糖酶Xyn22Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified Xyn22

2.4 重組木聚糖酶的酶學性質測定

2.4.1 重組木聚糖酶的最適反應溫度和溫度穩定性

在不同溫度下(20 ～65 ℃)測定木聚糖酶Xyn22的酶活。結果如圖3-A所示，重組酶Xyn22的最適反應溫度為40 ℃，當反應溫度在45 ℃時其相對酶活在80%以上。將適量的酶液放置在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃下恒溫水浴，每隔15 min取樣測定殘余酶活力。以保溫0 min重組酶的酶活力設為100%。結果表明：在40 ℃處理2 h后，Xyn22殘余酶活仍保持在80%左右；45 ℃處理2 h后，Xyn22酶活仍保持在60%左右；在50 ℃條件下處理20 min后，基本上檢測不到有殘余的酶活(圖3-B)。

圖3 Xyn22的最適反應溫度(A)和溫度穩定性(B)Fig.3 Optimum temperature (A) and thermostability (B) of Xyn22

2.4.2 重組木聚糖酶的最適pH值和pH穩定性

在不同pH緩沖液(2.0～10.0)下測定Xyn22的酶活力，最適pH為5.0，在4.5～6.5的范圍內酶活均在80%左右(圖4-a)。將適量的酶液置于pH 2.0～13.0的緩沖液中，處理2 h后，在最適作用條件下測定剩余酶活力。其中酶活力最高的設為100%，Xyn22在pH 3.0～pH 10.5范圍內較穩定，酶活保持在80%左右(圖4-b)。

圖4 Xyn22的最適反應pH(a)和pH穩定性(b)Fig.4 Optimum pH (a) and pH stability (b) of Xyn22

2.4.3 金屬離子和相關化學試劑對重組木聚糖酶活性的影響

在重組木聚糖酶Xyn22與底物進行反應的體系中加入不同的金屬離子或化學試劑，通過試驗發現Mg2+、Ba2+、EDTA和Hg2+對酶活有抑制作用，Hg2+可以使Xyn22幾乎完全失活。Co2+、Cu2+、K+、Mg2+、Al3+、Fe3+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Ni2+、Na+、Mn2+和對酶活的影響很小(表2)。

表2 金屬離子和化學試劑對重組木聚糖酶酶活的影響Table 2 Effects of metal ions and chemicals on the activityof recombinant xylanase

2.5 重組酶Xyn22水解木聚糖的產物分析

Xyn22水解樺木木聚糖生成的產物如圖5，在37 ℃及最適pH條件下，用純化酶液降解樺木木聚糖60 min，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖作為標準。由圖可以看出水解產物為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖為主的木寡糖，沒有木單糖產生，因此該酶為內切型木聚糖酶。

圖5 重組木聚糖酶Xyn22水解樺木木聚糖的產物分析Fig.5 Hydrolysis of xylan.Xyn22 were incubated with xylan for 60 mins, and the reaction products were analyzed by thin-layer chromatography

3 結論

以玉米皮為唯一碳源培養裂褶菌，分別測定發酵液中木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸苷酶的活性。結果顯示木聚糖酶最高酶活為7.45 U/mL、乙酰木聚糖酯酶最高酶活為3.41 U/mL、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶活相對較低，最高酶活分別為0.44 U/mL和0.074 U/mL。根據酶活測定結果克隆了裂褶菌的木聚糖酶基因Xyn22，完成了該基因在大腸桿菌中的表達、重組蛋白純化和性質研究。Xyn22的最適反應溫度為40 ℃，當反應溫度在45 ℃時其相對酶活在80%以上。Xyn22的最適pH為5.0，在4.5～6.5的范圍內酶活均在80%左右。Xyn22在pH 3.0～10.5范圍內較穩定，酶活保持在80%左右。Mg2+、Ba2+、EDTA和Hg2+對酶活有抑制作用，Hg2+可以使Xyn22幾乎完全失活。Co2+、Cu2+、K+、Mg2+、Al3+、Fe3+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Ni2+、Na+、Mn2+和對酶活的影響很小。水解樺木木聚糖分析顯示，該酶水解產物為木二糖及聚合度高于木二糖的木寡糖。

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