發酵工藝初步優化提高釀酒酵母工程菌株環磷酸腺苷產量

仇申珅，丁娟娟，曲淑玲，張軼群，陸海燕，鄒少蘭*

1(天津大學 化工學院，天津，300350)2(系統生物工程教育部重點實驗室，天津，300350) 3(中國石油大港油田團泊洼開發公司，天津，301607)

環式3’,5’-單磷酸腺嘌呤核苷(3’,5’-cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，簡稱環磷酸腺苷，是普遍存在于生物機體內并在生物機體的功能調節中起著重要作用的生理活性物質，被稱為第二信使[1]。基于cAMP的特殊作用和地位，cAMP一方面被作為重要的心血管系統藥物長期用于臨床治療[2-3]，一方面被證明在動物生產領域也有極大的潛在應用價值[4]。

目前已知臨床用cAMP均來自化學法合成法[5]。此法原料受限，存在較為嚴重的環境污染問題。相比之下，發酵法具有可實現持續生產、工藝簡單、能利用廉價的碳源、毒副作用小等多種優勢。而釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不僅具有工業化應用技術成熟、抗逆性強、為食品安全性GRAS微生物的優點，同時作為最早實現全基因組測序的微生物菌種，又是分子生物學和遺傳學研究的最重要模式生物之一[6]。因此，通過遺傳工程手段的改造實現以釀酒酵母為菌種的cAMP發酵法生產，預測會具有特殊的優勢。

釀酒酵母胞內嘌呤核苷酸的合成途徑有從頭合成途徑(de novo synthesis)和補救途徑(salvage pathway)，見圖1。在從頭合成途徑中，以PRPP為前體物經過一系列酶促反應生成IMP進而生成AMP和GMP；同時，在補救途徑中，培養基中的次黃嘌呤(hypoxanthine)、腺嘌呤(adenine)或鳥嘌呤(guanine)被細胞運輸到胞內，分別直接參與合成IMP、AMP或GMP。研究證明酵母嘌呤核苷酸代謝的調控機制極為復雜[1,7-8]，上述前體物的胞外供應情況也直接影響胞內2個途徑之間的協同、平衡。而cAMP通過cAMP-PKA信號轉導途徑發揮第二信使作用，其在細胞內的含量水平(涉及合成與降解過程)更受到極為嚴謹、精細、協同、及時的調控[9]。激發酵母中cAMP合成的一大刺激源是胞外葡萄糖和蔗糖含量水平[9]；另一方面如圖1所示，嘌呤核苷酸合成所需的起始原料5’-磷酸核糖(5-P-Ribose)經EMP和HMP途徑生成，嘌呤核苷酸合成所需的還原力和大量能量(ATP)主要由TCA提供(圖1)[10]，因此，EMP、HMP和TCA循環代謝流水平也必然影響到胞內cAMP合成水平。

作為最重要的模式生物之一，釀酒酵母cAMP相關基礎研究—以cAMP-PKA信號轉導途徑為核心的、被cAMP調控和調控cAMP的途徑及其機制研究非常多，發表論文數以千計，但將其用于發酵生產cAMP則未見報道[1,7-9]。本課題組成員進行了大量有關釀酒酵母cAMP-PKA信號轉導通路的研究，構建得到一系列不同基因修飾、不同遺傳背景的菌株，并首先關注到釀酒酵母可以大量積累胞外cAMP，進而比較系統地研究胞外cAMP濃度的影響因素和變化規律[8,11-12]。已有代謝工程研究證明：細胞途徑的修飾(合成)→修飾后細胞表型的嚴格評價(表型表征)→根據評價結果設計進一步的修飾(優化設計)，是一個不斷循環和遞進的菌種改進與生物過程整體優化的過程[13]。本研究擬基于圖1所示代謝途徑網絡和相關代謝調控機制的分析，初步評價釀酒酵母工程菌株發酵生產胞外cAMP的能力及其關鍵影響因素，嘗試考察通過優化發酵條件而調控代謝流、進一步提高cAMP產量的潛力，為下一步的菌株改造、發酵過程優化和最終充分發揮釀酒酵母平臺cAMP生產潛力打下基礎。

圖1 釀酒酵母嘌呤代謝及cAMP合成途徑Fig.1 Purine metabolism and cAMP synthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae

1 材料與方法

1.1 材料

G2為本室前期工作中構建的、已證明有一定胞外cAMP生產能力的釀酒酵母基因修飾工程菌株[11]。

1.2 培養基及培養條件

YPD培養基(g/L)：酵母抽提物10，蛋白胨20，D-葡萄糖20，固體培養基則還需添加瓊脂粉15。酵母菌株活化和種子液培養：固體培養為30 ℃培養箱倒置2～3 d至菌落生長至合適大小；液體培養為30 ℃、190 r/min過夜。

發酵培養基(g/L)：一般情況下為酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20～100，自然pH值。需要時在發酵培養基中添加其他組分如前體物次黃嘌呤、腺嘌呤。發酵條件：一般情況下為30 ℃、190 r/min、72～168 h。

1.3 發酵評價

種子液培養：挑取固體培養基平板上生長的菌落，接入裝有5 mL YPD培養液的試管中，30 ℃下190 r/min過夜培養，然后轉接進行二次擴大培養，所得菌液用作種子液。

發酵培養：上述新鮮種子液接種到裝有25 mL發酵培養基的100 mL三角瓶中，控制初始OD600值在0.3左右，30 ℃、190 r/min下發酵，間隔12或24 h取樣進行分析。

發酵液的分析：1.OD600測定：將發酵樣品適當稀釋后測定OD600，檢測生長情況；2.HPLC分析胞外cAMP和腺嘌呤濃度：將發酵樣品在13 000 r/min、2 min條件下離心，取上清液進行適當稀釋，用孔徑0.22 μm的濾膜過濾，濾液用于色譜檢測：美國Waters公司Waters Alliance2695高效液相色譜儀，檢測波長258 nm，Thermo Syncronis C18色譜柱，流動相組分為：(5.78 g/L KH2PO4，2.72 g/L四丁基溴化銨，用磷酸調節pH值至4.3)∶乙腈=85∶15，流速1 mL/min，柱溫35℃；3.HPLC分析葡萄糖和乙醇質量濃度：發酵樣品的處理同前，色譜檢測條件為：安捷倫公司示差檢測器，Bio-Rad公司Aminex HPX-87H柱，流動相為4 mmol/L H2SO4，流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃。

2 結果與分析

如前言所述，包括cAMP在內的嘌呤核苷酸合成要消耗大量能量，因此足量的供氧和溶氧是必需的；cAMP的特殊地位決定了它的活躍合成和分泌必需有足量的、高活性的細胞生成，而大量前期工作也證明了較高水平的胞外cAMP生產是以一定的生物量積累為前提，菌體生長不佳時，胞外cAMP水平必然低；對比分析cAMP的分子式C10H12N5O6P和釀酒酵母菌體有機成分含量(碳46%～52%，氮6.0%～8.5%)，要同時滿足生物量合成和cAMP合成的需要，培養基碳氮比的控制是必要和關鍵的；葡萄糖是經cAMP-PKA途徑刺激cAMP合成的刺激源，葡萄糖濃度效應也有待觀察。

因此，本研究以釀酒酵母常用的培養基YPD(酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，D-葡萄糖20 g/L)和好氧培養條件30 ℃、190 r/min為基礎，首先考察葡萄糖濃度對工程菌株生長和發酵產生胞外cAMP的影響。

2.1 葡萄糖對G2菌株生長和生產胞外cAMP的影響

結果見圖2。由圖2可知：100、50 g/L葡萄糖下的生長彼此沒有明顯差異，最大OD600值分別為48.25(96 h)和49.60(96 h)，而20 g/L葡萄糖下最大OD600值為33.35(48 h)；與生長相應，20 g/L葡萄糖下48 h達到cAMP濃度最大值(935.3 μmol/L)，100、50 g/L葡萄糖下cAMP生產都在48～72 h時表現出停頓，至96 h繼續上升(濃度分別為1 942.0、1 526.8 μmol/L)；50、20 g/L葡萄糖搖瓶發酵都在24 h基本耗盡葡萄糖的同時，乙醇濃度達到最大(1.817、0.568 g/L)，而100 g/L葡萄糖發酵則在96 h時仍有1.498 g/L的殘糖，乙醇質量濃度在48 h達最大值1.808 g/L，后下降。

圖2 不同葡萄糖濃度下的生長(A)、CAMP濃度(B)、葡萄糖濃度(C)和乙醇濃度(D)曲線Fig.2 The growth(A), cAMP(B), glucose(C) and ethanol(D) curves at different glucose concentrations

這些結果初步暗示了細胞生長與cAMP生產既相互關聯又相對獨立的復雜關系；大量副產物乙醇的產生也必然消耗碳源、降低底物轉化率。

需要說明的是：在上述條件下，作為對照設置的實驗室菌株W303-1A發酵液的胞外cAMP有時檢測不到，有時低至1～3 μmol/L。

2.2 接種方式對G2菌株生產胞外cAMP的影響

由2.1結果可知：YPD培養基、30 ℃、190 r/min下的種子液培養亦會產生較高水平的胞外cAMP。為考察發酵體系起始cAMP水平對發酵的影響，兼顧觀察種子液殘余培養基成分的影響，設置了2種方式接種：種子液直接接種和種子液先離心收集細胞再用無菌水重懸接種。結果見表1，發酵葡萄糖質量濃度為100 g/L，其余發酵條件同前。結果顯示二者沒有明顯差異。

2.3 次黃嘌呤對G2菌株生產cAMP的影響

根據圖1所示代謝途徑，考察了添加前體物次黃嘌呤的效果。次黃嘌呤溶解度低，設計的最大添加量2 g/L。結果見表2。發酵葡萄糖質量濃度為100 g/L，其余發酵條件同前。

表1 接種方式對菌株生長和發酵的影響Table 1 Effect of inoculation method on strain growthand fermentation

表2結果表明次黃嘌呤對菌株生長基本沒有影響的同時，僅能有限地提高cAMP產量。

2.4 腺嘌呤和酵母粉/蛋白胨含量對G2菌株生產cAMP的影響

與次黃嘌呤不同，預實驗證明腺嘌呤有明顯的提高cAMP產量的效果；但濃度過高的情況下，會明顯抑制生長從而最終影響到cAMP產量，同時發酵結束時會有大量腺嘌呤剩余、不能被利用，增加了發酵成本。另一方面，對比圖2中100和50 g/L葡萄糖下的生長和發酵情況，分析酵母粉、蛋白胨相對于葡萄糖含量偏低構成了100 g/L葡萄糖下生長與發酵的制約。因此，這里同時考察添加腺嘌呤和提高酵母粉、蛋白胨含量的效果：1.根據預實驗結果，確定腺嘌呤的添加量為0.625 g/L(在圖3中標注為A 0.625)；2.將前面實驗采用的10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨含量簡稱為1*YP，將含量翻倍后的20 g/L酵母粉、40 g/L蛋白胨含量簡稱為2*YP。結果見圖3和表3。

表2 次黃嘌呤對菌株生長和發酵的影響Table 2 The effects of hypoxanthine on the growth and fermentation

圖3 腺嘌呤和1*YP或2*YP中的生長(A)和發酵(B)曲線Fig.3 The growth(A) and fermentation(B) curves in the media with adenine and 1*YP or 2*YP

次黃嘌呤終質量濃度/(g·L-1)1 (1?YP,A0)2 (1?YP,A0.625)3 (2?YP,A0)4 (2?YP,A0.625)最大OD600值50.23±2.7446.10±1.8456.60±3.1154.80±4.3396 h cAMP濃度/(μmol·L-1)1 972.0±122.52 712.7±214.32 374.4±121.13 422.2±102.7最大cAMP濃度/(μmol·L-1)1 972.0±122.53 387.3±277.84 311.2±308.34 678.1±238.6相對于樣品1最大濃度的比值11.7182.1862.372相對于樣品3最大濃度的比值11.085

由圖3和表3可知：維持100 g/L葡萄糖質量濃度不變的情況下，將酵母粉、蛋白胨含量加倍能將cAMP濃度提高到4 311.2 μmol/L，為對照的2.186倍；在此基礎上添加腺嘌呤能繼續提高產量8.5%，但遠遠低于1*YP培養基中添加腺嘌呤的增產效果(71.8%)；添加0.625 g/L腺嘌呤仍然表現出了輕微的生長抑制；生長和cAMP產量之間仍然表現出既相互關聯又相對獨立的復雜關系。

3 討論

如前言所述，cAMP在胞內的含量受到極為嚴格的控制。在基因修飾調控相關代謝及其調節機制的情況下，提供菌株良好的環境條件、考察和優化生長和發酵工藝參數，是進一步提高目的產物產量、充分發揮其生產潛能的必需和重要的一環，也是下一輪菌種改造和發酵優化的基礎。本研究基于文獻報道(圖1)代謝途徑及其調控機制研究，以及實驗室前期工作基礎，將工作重點放在培養基組分上，選擇碳源葡萄糖、氮源酵母粉/蛋白胨和前體物次黃嘌呤/腺嘌呤進行生長和發酵觀察。實驗結果一方面證實了優化碳氮比的顯著效果，一方面暗示了細胞生長與cAMP發酵之間存在著復雜的聯系；前體物腺嘌呤添加到1*YP和2*YP培養基中增產效應上的顯著差異，推測是嘌呤合成2種途徑——從頭合成途徑和補救途徑之間平衡因碳氮比和碳氮比所至菌體生長差異而變化的反映。

因此，下一步的工作有必要通過正交設計深入考察葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和腺嘌呤之間在糖耗-生長-cAMP發酵-乙醇產生關系上更為精細、全面的相互作用，在此基礎上增加溶氧和代謝流分析，以更深入了解發酵過程調控和優化最核心的問題之一——實施生長與cAMP發酵分階段控制的必要性、可能臨界點和敏感參數。

另一方面，本工作雖然是發酵工藝部分參數的初步優化考察，但結果已經清楚顯示出了酵母與其他微生物(尤其是細菌)在cAMP代謝及其調控、生產優化措施上的顯著差別[1,9,14-16]。添加次黃嘌呤前體物可將節桿菌cAMP產量從0.43 g/L提高到4.08 g/L，效應極為顯著[15]；其他對節桿菌增產有效的措施(包括添加腺嘌呤前體物)[15]，在本研究中則觀察到效果有較大的出入(部分結果沒有顯示)。事實上，對cAMP信號通路及其調控機制認識、研究的程度制約著對它的利用水平。作為最重要的模式生物之一，釀酒酵母cAMP相關研究一直未曾間斷過[7,9,17-19]；而細菌到目前為止還沒有被發現有類似酵母cAMP-PKA信號轉導途徑中依賴于cAMP的蛋白質激酶PKA[1,16]。本研究首次報道了釀酒酵母生產cAMP發酵工藝的初步優化，結果一方面如前提供了進行下一步工作的線索，另一方面則進一步提示了在迄今為止對生物cAMP代謝途徑網絡和相關代謝調控機制認識基礎上不斷循環和遞進的菌種改進與生物過程整體優化的必要性和艱巨性。唯有不斷循環和遞進改造菌種和優化過程，才能最終充分發揮釀酒酵母平臺cAMP生產潛力，開辟微生物發酵生產cAMP新途徑，真正推動高值醫藥產品的綠色清潔生產。

[1] GANCEDO J M.Biological roles of cAMP: variations on a theme in the different kingdoms of life[J].Blological Reviews, 2013, 88(3):645-668.

[2] 黨立,王希敏,韓利文，等.環磷酸腺苷的臨床應用進展[J].山東科學,2007,20(3):61-64.

[4] 汪善鋒,陳安國.環腺苷酸的生理功能及在動物生產中的應用[J].中國飼料,2003(10):3-5.

[5] 李良鑄,李明曄.現代生化藥物生產關鍵技術[M].北京:化學工業出版社, 2006.

[6] 汪天虹.微生物分子育種原理與技術[M].北京:化學工業出版社,2005.

[7] LJUNGDAHL P O, DAIGNAN-FORNIER B.Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism inSaccharomycescerevisiae[J].Genetics, 2012, 190(3): 885-929.

[8] 徐歡歡,程麗娜,鄒少蘭,等.利用轉錄調控因子Bas1p和Bas2p協同作用提高釀酒酵母cAMP產量的研究[J].微生物學通報, 2016, 43(2): 370-378.

[9] VANDAMME J,CASTERMANS D,THEVELEIN J M.Molecular mechanisms of feedback inhibition of protein kinase A on intracellular cAMP accumulation[J].Cellular Signalling, 2012,24(8):1 610-1 618.

[10] 程麗娜，陸海燕，曲淑玲，等.微生物發酵法生產環磷酸腺苷研究進展[J].中國生物工程雜志，2018,38(2)：102-108.

[11] 高文萱.高產cAMP釀酒酵母菌株的構建[D].天津:天津大學碩士論文,2012.

[12] 王凱,姬曉兵,鄒少蘭，等.整合過表達嘌呤代謝途徑關鍵酶基因提高釀酒酵母菌株環磷酸腺苷產量[J].食品與發酵工業,2016, 42(8): 25-30.

[13] 陳洵,周世奇,鄒少蘭，等.功能基因組學與代謝工程:微生物菌種改進與生物過程優化,化工學報[J].2006,57(8):1 792-1 801.

[15] CHEN X C,SONG H, FANG T,et al.Enhanced cyclic adenosine monophosphate production byArthrobacterA302 through rational redistribution of metabolic flux[J].Bioresource Technology, 2010,101(9):3 159-3 163.

[16] MATANGE N.Revisiting bacterial cyclic nucleotide phosphodiesterases: cyclic AMP hydrolysis and beyond[J].FEMS Microbiology Letters, 2015,362 (22): UNSP fnv183.

[17] ENGELBERG D,PERLMAN R,LEVITZKI A.Transmembrane signaling inSaccharomycescerevisiaeas a model for signaling in metazoans: state of the art after 25 years[J].Cellular Signalling, 2014, 26 (12): 2 865-2 878.

[18] PéREZLANDERO1 S,SANDOVALMOTTA S,MARTNEZ ANAYA C,et al.Complex regulation of Hsf1-Skn7 activities by the catalytic subunits of PKA inSaccharomycescerevisiae: experimental and computational evidences[J].BMC Systems Biology, 2015, 9(1):1-17.

[19] STEMAET-ORNSTEIN J,CHEN S,BHATNAGAR R,et al.Model-guided optogenetic study of PKA signaling in budding yeast[J].Molecular Biology of the Cell, 2017, 28(1): 221-227.