超聲處理對鷹嘴豆蛋白乳化性的影響

劉昕，金明良，覃小麗，鐘金鋒

(西南大學 食品科學學院，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶，400715)

鷹嘴豆(又稱桃爾豆、雞心豆)，是一類營養價值較高的豆類植物。它含有豐富的皂苷、異黃酮等營養成分，具有降血壓血脂、延緩女性衰老的作用[1]，是一種廣受消費者喜愛的食品原料。鷹嘴豆中蛋白質含量高于28%[1]，其蛋白質易于消化，具有的8種人體必需氨基酸含量優于燕麥，是一類優質的蛋白來源[1]。隨著人們對膳食健康食品的需求增加和重視，對鷹嘴豆蛋白功能特性的影響因素進行研究，有助于開發利用鷹嘴豆相關資源(如：鷹嘴豆植物蛋白飲品)。

目前鷹嘴豆蛋白的研究主要集中在其分離純化[2-3]，鷹嘴豆功能性肽的制備[4]，以及鷹嘴豆蛋白的性能表征[3]。研究顯示，在低離子強度下，鷹嘴豆蛋白有較低的溶解性和乳化性[5]，改善鷹嘴豆蛋白的乳化性有助于拓展其在食品體系中的應用。顧楠等[6]采取不同方法(如：超聲波、超高壓等物理方法，酶法、化學法)處理鷹嘴豆蛋白，在一定程度上提高其性能。然而，關于處理條件(如：超聲時間、功率)對鷹嘴豆蛋白乳化性影響程度尚不清楚；另外，環境因素(溫度、pH值等)對經處理后的鷹嘴豆蛋白的乳化性質的影響也有待研究。因此，本文將研究超聲處理條件(超聲功率和時間)對鷹嘴豆蛋白乳化性的影響，并同時分析超聲處理后鷹嘴豆蛋白乳化性質在環境因素(pH和溫度)影響下的變化規律，以期為改善鷹嘴豆蛋白乳化性和開發相關產品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆，烏魯木齊市廣泰峰糖酒有限公司；石油醚(沸程30～60 ℃)、乙醇、NaOH、NaCl、HCl：分析純；超純水，Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)制備；大豆油，中糧福臨門食品營銷有限公司。

1.2 實驗儀器

BJ-300型粉碎機，德清拜杰電器有限公司；JY98-IIIDN型超聲細胞粉碎儀(探頭直徑20 mm)，寧波新芝生物科技股份有限公司；RW20數顯型混合頂置式機械攪拌器，德國IKA公司；DF-101S型水浴鍋，河南鞏義予華儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；AXTG-16G型離心機，常州安信儀器設備有限公司；雷磁pHS-3C酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鷹嘴豆蛋白的提取

室溫下純水浸泡鷹嘴豆12 h，將其去皮后置于烘箱干燥(50 ℃，48 h)，再將去皮鷹嘴豆粉碎成鷹嘴豆粉。采用石油醚對鷹嘴豆粉進行脫脂(V石油醚∶V豆粉=2∶1，30 ℃下機械攪拌(500 r/min)60 min)，待豆粉自然沉降后傾出溶劑(上層)，繼續用石油醚對該物料(下層)進行脫脂。然后，在50 ℃干燥條件下對已分離有機溶劑的物料進一步脫除殘留的有機溶劑，揮干溶劑后所得的物料稱為脫脂鷹嘴豆粉。采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白[7]，并稍作改進。將脫脂鷹嘴豆粉與水混合[1∶10(g∶mL)]，用NaOH溶液(2 mol/L)調pH至9.0，室溫下機械攪拌(500 r/min)3 h后離心(5 000 r/min，7 min)，收集含蛋白質的上清液。將沉淀與水以1∶5的比例混合，重復上述步驟2次。將所有上清液混合后用HCl(0.1 mol/L)調pH至4.5后離心(8 000 r/min，20 min)。收集沉淀后進行冷凍干燥，獲得鷹嘴豆蛋白。將鷹嘴豆蛋白置于干燥器密封保存，用于后續實驗。

1.3.2 鷹嘴豆蛋白的超聲處理

將鷹嘴豆蛋白制成60 g/L的溶液，在超聲過程中通過冰浴進行控溫(< 49 ℃)，采用不同超聲功率(204、396、600 W)和超聲時間(10、15、30 min)處理鷹嘴豆蛋白。將超聲處理的蛋白溶液進行冷凍干燥。以蛋白的氮溶指數(nitrogen solubility index，NSI)、持油性以及乳化穩定性(emulsification stability index，ESI)指標，評價不同條件超聲處理對鷹嘴豆蛋白乳化性的影響[8-9]。

1.3.3 鷹嘴豆蛋白的乳化性評價

1.3.3.1 鷹嘴豆蛋白NSI的測定

分別稱取0.5 g超聲處理前、后的鷹嘴豆蛋白，溶于30 mL水中，用0.1 mol/L的HCl溶液或0.1 mol/L的NaOH溶液調節pH為7.0，定容至50 mL，室溫攪拌30 min后，離心(4 200 r/min，20 min)，將上清液轉移至50 mL容量瓶，定容，最后取5 mL樣液用分光光度法測定上清液中蛋白質含量，用凱氏定氮法測定鷹嘴豆蛋白質含量，按照公式(1)計算NSI[10-11]。

(1)

1.3.3.2 鷹嘴豆蛋白持油性的測定

分別稱取超聲處理前、后的鷹嘴豆蛋白樣品(0.25 g，記為m1)于15 mL離心管中，加入1.5 mL大豆油(質量記為m2)，攪拌1 min后靜置30 min，離心(3 500 r/min，25 min)后取出游離油，稱量游離油的質量(m3)，按照公式(2)計算鷹嘴豆蛋白的持油性[11]。

(2)

1.3.3.3 鷹嘴豆蛋白ESI的測定

分別將超聲處理前、后的鷹嘴豆蛋白樣品制成2 g/L樣品溶液(用10 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液作溶劑)，調節樣品溶液至不同pH值(3、4、5、7、9)，在不同溫度(20、30、40、60、70 ℃)條件下攪拌3 h，加10 mL大豆油，均質(10 000 r/min，1 min)，分別取均質后(0和10 min)樣液50 μL，用1 g/L SDS溶液稀釋100倍，測定500 nm處的吸光度，以SDS溶液為空白[3]。按照公式(3)計算鷹嘴豆蛋白的ESI[12]。

(3)

式中：A0，均質后0 min乳液的吸光度；A10，均質后乳液靜置10 min后的吸光度。

1.4 數據處理

每個實驗至少重復2次，每個樣品的各指標測定至少平行測定3次，結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 18.0中的Duncan′s test檢驗進行組間均值顯著性分析(p<0.05被認為有顯著差異)，用Origin 8.0作圖表。

2 結果與分析

2.1 超聲處理對鷹嘴豆蛋白NSI的影響

蛋白質的溶解度與其乳化性呈正相關，溶解度越高的蛋白質，乳化性能越優[3]。在本實驗中，通過測定NSI來評價鷹嘴豆蛋白溶解度。在中等超聲功率(396 W)情況下，考察超聲時間對鷹嘴豆蛋白NSI的影響。由圖1可知，NSI隨著超聲時間的延長呈現先增加后減小的趨勢。在本實驗條件下，延長超聲時間顯著提高鷹嘴豆蛋白NSI。當超聲時間為15 min時，鷹嘴豆蛋白的NSI達到最高，說明此時蛋白的溶解度最高，其NSI比超聲處理前的提高了16%。

在超聲時間為15 min時，超聲功率對鷹嘴豆蛋白NSI的影響如圖2所示。隨著超聲功率的增加，鷹嘴豆蛋白的NSI呈現先增加后減小的趨勢。當超聲功率為396 W時，鷹嘴豆蛋白的NSI達到最大值。

鷹嘴豆蛋白的NSI在一定的超聲功率和時間范圍內顯著提高并達到最大值，這意味著一定的超聲處理條件利于提高鷹嘴豆蛋白的溶解度(圖1、圖2)，這與孫英杰的研究結果是一致的。孫英杰研究顯示大豆蛋白溶解度和活性巰基量均隨超聲時間的增加而呈先增加后減小的趨勢，這可能是因為超聲波的空化作用破壞了蛋白質內部的二硫鍵，蛋白質分子展開，溶解度增加[13-14]。畢爽等研究顯示黑豆蛋白巰基量隨超聲功率的增加呈現先增加后減小的趨勢[15]，這主要由于超聲處理破壞了蛋白質二硫鍵，使其轉化成巰基；而超聲功率對黑豆蛋白巰基量與NSI的影響規律是一致的，進一步提示了適當超聲處理后蛋白NSI的提高與蛋白質的二硫鍵破壞有關。此外，超聲波會使蛋白質形成非共價鍵分子，與水的結合能力增強，溶解度提高[13-14]。當提高超聲功率(>396 W)和延長時間(>15 min)時，鷹嘴豆蛋白的NSI有降低趨勢，這主要由于蛋白質在過高功率或過長時間超聲處理下變性程度加劇，蛋白質凝集，分子表面親水基團減少，溶解度降低[13]。

圖2 超聲功率對鷹嘴豆蛋白NSI的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on solubility of chickpea protein注：不同小寫字母(a、b)代表NSI的顯著性差異。

2.2 超聲波處理對鷹嘴豆蛋白持油性的影響

持油性表示蛋白質吸附脂質的能力，持油性越強，蛋白質與脂質結合能力越強。本實驗中，通過測定持油性來評價鷹嘴豆蛋白持油能力。在中等超聲功率(396 W)情況下，考察超聲時間對鷹嘴豆蛋白持油性的影響，如圖3所示。在15 min內，持油性隨著超聲時間的延長呈現快速增大的趨勢；在15 min之后，持油性則趨于穩定。當超聲時間達到15 min時，持油性達到2.13 g/g，此時蛋白的持油性能優異，其持油性是未超聲處理的1.6倍。

圖3 超聲時間對鷹嘴豆蛋白持油性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on oil-holding capacity of chickpea protein注：不同小寫字母代表持油性的顯著性差異。

在超聲時間為15 min時，超聲功率對鷹嘴豆蛋白持油性的影響如圖4所示。由圖4可知，持油性隨著超聲功率的提高先增加后減小。當超聲功率在204～396 W之間時，鷹嘴豆蛋白持油性較大(約2.1 g/g)，其持油性是未超聲處理的1.6倍。

圖4 超聲功率對鷹嘴豆蛋白持油性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on oil-holding capacity of chickpea protein注：不同小寫字母代表持油性的顯著性差異。

鷹嘴豆蛋白的持油性在一定的超聲功率和時間范圍內顯著提高并達到最大值(圖3、圖4)，這主要是因為超聲波促使蛋白質分子結構疏松，蛋白質內部疏水結構暴露，分子更易與脂質結合[14]，持油性能增強。當延長時間(15～30 min)，鷹嘴豆蛋白持油性趨于穩定，這可能由于在中等功率(396 W)下延長時間的不足以使蛋白質未發生嚴重變性。隨著超聲功率的提高(>396 W)，持油性呈現下降趨勢，這主要是因為蛋白質的變性程度增加，聚集情況嚴重，持油性下降[16]。

2.3 pH對超聲波處理后的鷹嘴豆蛋白ESI的影響

ESI表示乳液保持穩定狀態的能力，ESI越高，表示乳化性質越優，在本實驗中，用ESI評價鷹嘴豆蛋白的乳化性。pH對經不同超聲功率處理的鷹嘴豆蛋白ESI的影響結果如圖5所示。經處理的鷹嘴豆蛋白的ESI明顯高于未經處理蛋白的ESI，這與楊勇等人的研究結果是一致的。楊勇等研究結果顯示超聲處理會顯著增加蛋白質乳化性(超聲功率400 W，時間30 min，ESI提高2.3%左右)，進一步通過紅外光譜分析發現該超聲條件處理后的綠豆蛋白β-轉角結構明顯增加了6.44%，此結構的增加使得蛋白質變得疏松，進而使得綠豆蛋白的ESI明顯高于未經處理蛋白的ESI[17]。經過超聲處理的鷹嘴豆蛋白ESI隨pH的變化趨勢與未經處理的類似，204 W和396 W超聲處理的鷹嘴豆蛋白的ESI接近，且高于經高等超聲功率(600 W)處理的鷹嘴豆蛋白的ESI。此外，結合對溶解度與持油性的研究結果(圖2和圖4)，超聲功率為396 W時，鷹嘴豆蛋白性質較優異，因此選擇396 W超聲功率處理鷹嘴豆蛋白，接著研究pH對不同超聲時間處理的鷹嘴豆蛋白ESI的影響。

圖5 在不同pH條件下，超聲功率對鷹嘴豆蛋白ESI的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on chickpea protein ESI at different pH注：同組處理條件中不同字母和數字代表超聲處理蛋白ESI的顯著性差異。

當超聲功率為396 W時，pH對經不同超聲時間處理的鷹嘴豆蛋白ESI的影響結果如圖6所示。由圖6可知，在pH為5、7時，經不同時間超聲處理的鷹嘴豆蛋白ESI差異不顯著，而在其余pH值時，ESI隨著超聲時間的增加先增加后減小，當超聲時間為15 min時，ESI最高。ESI隨著超聲功率增大以及超聲時間的延長先增大后減小(圖5和圖6)，這主要是由于當蛋白質受到高等功率或長時間超聲處理時，蛋白質變性嚴重，乳化性變差，ESI下降[14]。

圖6 在不同pH條件下，超聲時間對鷹嘴豆蛋白ESI的影響Fig.6 Effects of ultrasonic time on chickpea protein ESI at different pH注：同組處理條件中不同字母和數字代表超聲處理蛋白ESI的顯著性差異。

由圖5、圖6可知，鷹嘴豆蛋白ESI先呈下降趨勢(pH<4)，之后ESI隨pH增加呈現先增大后減小的趨勢(pH>4)。ESI在pH為4～5時較低，這主要由于此時的pH接近鷹嘴豆蛋白的等電點[3]，蛋白質發生靜電屏蔽作用，不溶性蛋白增加。綜上所述，適當的超聲處理可以提高鷹嘴豆蛋白的ESI。當鷹嘴豆蛋白處于等電點附近時，ESI會達到最低值。

2.4 溫度對超聲處理后的鷹嘴豆蛋白ESI的影響

超聲時間為10 min時，經不同超聲功率處理的鷹嘴豆蛋白ESI隨溫度變化趨勢如圖7所示。

圖7 在不同溫度條件下，超聲功率對鷹嘴豆蛋白ESI的影響Fig.7 Effects of ultrasonic power on chickpea protein ESI at different temperature注：同組處理條件中不同字母和數字代表超聲處理蛋白ESI的顯著性差異。

由圖7可知，在20 ℃條件下，經超聲處理的鷹嘴豆蛋白ESI明顯高于未處理蛋白質ESI，這主要因為超聲處理增加了疏水肽的數量，使得蛋白更易形成膠束，乳化性變優，ESI升高[12]。經204 W超聲功率處理的鷹嘴豆蛋白質在30、40和60 ℃下，與未經處理的鷹嘴豆蛋白ESI無顯著性差異，這可能是由于超聲功率太小且超聲時間太短，蛋白質變性程度相差微小導致的。但在部分溫度的條件下，ESI隨超聲功率的增加(396～600 W)呈現增大的趨勢(30、60 ℃)，這主要因為超聲功率的增加促進了蛋白質的變性，疏水肽數量增加，乳化性變優[12]。而70 ℃條件下，隨著超聲功率的增加，鷹嘴豆蛋白ESI處于先增后減的狀態，這可能是由于超聲和溫度的累積作用下，蛋白質變性嚴重，分子聚集，乳化性變差，ESI下降。由于在所考察溫度下600 W超聲處理鷹嘴豆蛋白的ESI較高，因此選擇超聲功率為600 W處理鷹嘴豆蛋白，并考察該處理蛋白在不同溫度下ESI的變化情況。

當超聲功率為600 W時，經不同超聲時間處理的鷹嘴豆蛋白ESI隨pH變化趨勢如圖8所示。由圖8可知，在20 ℃條件下，超聲10 min以及15 min的鷹嘴豆蛋白ESI顯著高于未經超聲處理的，而隨著時間的繼續延長(30 min)，ESI明顯減小。這主要是由于超聲時間的增加加劇蛋白質變性程度，蛋白質分子聚集嚴重，溶解度下降，乳化性質變差，ESI減小[14]。

據圖7、圖8中未經超聲處理蛋白的ESI變化趨勢線可知，當溫度小于40 ℃時，不同溫度下ESI無顯著性差異(p>0.05)。當溫度大于40 ℃，ESI隨溫度升高先增大后減小。當溫度處于50～60 ℃之間時，ESI較高。這主要是因為鷹嘴豆蛋白在40～55 ℃時其溶解度較高(約為80%)[3]，進而提高了其ESI。隨著溫度的持續升高，由于分子二級、三級結構破壞，蛋白質發生聚集作用，乳化性減小，ESI下降[18]。但由圖7、圖8中超聲處理的蛋白質ESI的趨勢可發現，在20～40 ℃時，ESI呈下降趨勢，這可能是由于超聲促使蛋白質變性，分子結構改變，隨著溫度的增加，蛋白質氫鍵減少，持水力下降[18]，蛋白質乳化性質變低。在較高溫度條件下(30～70 ℃)，未經超聲處理以及經10 min超聲時間處理的鷹嘴豆蛋白ESI的最高值在60 ℃，而經15 min以及30 min超聲時間處理的鷹嘴豆蛋白ESI最高值則是在40 ℃。這可能因為溫度以及超聲處理的雙重作用，使得蛋白質在超聲時間增加的條件下，臨界變性溫度減小。綜上所述，由于溫度促使鷹嘴豆蛋白變性的原因，ESI隨溫度的增加先增大后減小。

3 結論

在一定超聲功率(≤396 W)以及一定超聲時間(≤15 min)范圍內，由于超聲波使鷹嘴豆蛋白發生輕微變性，使得蛋白結構疏松，疏水肽數量增加，從而使鷹嘴豆蛋白溶解度(提高16%)、持油性(提高1.6倍)以及乳化穩定性都有提升。但過高功率或長時間超聲處理會使蛋白質變性嚴重，分子聚集，從而使得蛋白質溶解度、持油性以及乳化穩定性都不再上升甚至下降。在蛋白質等電點附近(pH 4～5)時，由于蛋白質呈電中性乳化穩定性最低。在高溫下(40～70 ℃)，由于蛋白質變性乳化穩定性隨著溫度增加先上升后下降。

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