枸杞多糖脂質體制備工藝

李妍，方芳，曹珂珂，王娣，許暉

(蚌埠學院 食品與生物工程學院， 安徽 蚌埠， 233030)

枸杞多糖組成為蛋白多糖——易溶于熱水、稀酸和稀堿溶液，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑的蛋白多糖，即由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖成分組成[1]。枸杞多糖為枸杞子的主要功能活性成分，具有調節機體免疫功能、增強記憶力、防止遺傳損傷、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、降血脂、降血糖、耐缺氧等多種作用[2-4]。但枸杞多糖為水溶性物質，生物利用度低，使枸杞多糖被開發成藥用劑型最大發揮其療效帶來很大困難。

脂質體是一種人工膜，在水中磷脂分子親水頭部插入水中，脂質體疏水尾部伸向空氣，攪動后形成雙層脂分子的球形脂質體[5]。脂質體可被用于藥物制備，利用脂質體溶于細胞膜的性質，將藥物送入細胞內部[6]。脂質體系統的基本特征主要表現為[7]：脂質體雙分子層可以同時包埋親水和疏水性物質，水分散性好；脂質體的類生物膜結構使其生物相容性好，無免疫抑制作用，毒性小；提高被包合物質的穩定性，保護定向至某些治療的靶器官或組織中，提高藥物的療效[8]。20 世紀 70 年代RAHMAN等[9]首先將脂質體作為藥物載體應用，脂質體就以其高度的生物靶向性、長效緩釋性和低毒性引起了廣大藥劑工作者的關注。

本課題采用薄膜分散水化法探究包合工藝，改進傳統的脂質體制備條件，采用大豆卵磷脂和膽固醇對枸杞多糖進行包合，以期提高枸杞多糖的穩定性，提高其生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞多糖提取物(標示量為60%)購于恒德堂原料提取廠；PBS緩沖液，實驗室自配；大豆卵磷脂(純度≥97%)，上海虹泉生物科技有限公司；膽固醇、三氯甲烷、(NH4)2SO4、苯酚、濃H2SO4(均為分析純)、一級純化水；實驗室自制。

1.2 儀器與設備

KDC-160HR高速冷凍離心機，安徽中華中佳科學儀器有限公司；電子天平AB323，上海海康電子儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JK-500DB型數控超聲清洗器，合肥金尼克機械制造有限公司； HH-501恒溫振蕩器，蘇州威爾實驗用品有限公司；電子天平YP-B1003，上海光正醫療儀器有限公司；旋轉蒸發儀RE-2000B，鞏義市予華儀器有限責任公司；數顯恒溫水浴鍋HH-1，金壇市杰瑞爾電器有限公司；ZEISS Merlin Compact場發射掃描電鏡，Carl Zeiss MERLIN Compact Germany；冷凍干燥機，Gold SIM International Group CO.LTD。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線

稱取0.100 0 g葡萄糖標準品，定容到100 mL，搖勻；再移取10 mL定容到100 mL，搖勻，得0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液；分別取葡萄糖標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，再加入蒸餾水至2 mL，滴加5%苯酚溶液1 mL，再迅速滴加5.0 mL的濃H2SO4并搖勻。水浴鍋中沸水浴15 min，冷卻后在490 nm下測量吸光度[10]。以葡萄糖溶液質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，作標準曲線，得到線性回歸方程：y=11.036x-0.001 5，R2=0.999 5。

1.3.2 枸杞多糖溶液的配制

稱取多糖提取物1.00 g，用1 000 mL水完全溶解，取出100 mL稀釋10倍后存儲待用。同上，配制濃度為0.100 0、0.050 0、0.033 3、0.025 0、0.020 0、0.016 7 g/L多糖PBS緩沖液各1 000 mL待用。按1.3.1方法測定吸光度，計算枸杞多糖包含率[11-12]。

(1)

注：制備脂質體所加入枸杞多糖總量，稱量記為m總；被包合枸杞多糖測定：取枸杞多糖脂質體置于透析袋中，通過在40℃下水化至脂質膜脫落也即是破乳后得到澄清溶液，測定其多糖吸光度計算得枸杞多糖含量記為m1。

1.3.3 單因素實驗

1.3.3.1 以藥脂比(枸杞多糖與膜材的質量比)為影響因素的制備

取1 g大豆卵磷脂和0.25 g膽固醇→加入15 mL三氯甲烷→超聲直至膜材充分溶解于三氯甲烷→旋轉蒸發直至出現膜層→揮去三氯甲烷→按照藥脂比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60混合→40 ℃下水化，至脂質膜脫落(恒溫振蕩260 r/min)→測定吸光度→平行3次，計算包合率[13]。

1.3.3.2 以膜材比(大豆卵磷脂與膽固醇的質量比)為影響因素的制備

取膜材大豆卵磷脂：膽固醇分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1→加入15 mL氯仿→超聲直至膜材充分溶解于氯仿→旋蒸直至出現膜層→揮去氯仿→按照藥脂比為1∶10混合→40 ℃下水化，至脂質膜脫落(恒溫振蕩260 r/min)→測定吸光度→平行3次，計算包合率[14]。

1.3.3.3 以水化溫度為影響因素的制備

稱取1 g大豆卵磷脂和0.25 g膽固醇→加入15 mL氯仿→超聲直至膜材充分溶解于氯仿→旋轉蒸發直至出現膜層→揮去氯仿→按照藥脂比為1∶10混合→20、30、40、50、60、70 ℃下水化，至脂質膜脫落(恒溫振蕩260 r/min)→測定吸光度→平行3次，計算包合率。

1.3.4 設計制備脂質體的響應面實驗

通過單因素實驗研究，可以看出藥脂比、膜材比和水化溫度對包合率有影響，故采用Box-Benhnken軟件[15]，以枸杞多糖包合率為響應值，藥脂比、膜材比、水化溫度為實驗變量設計響應面實驗。實驗因素水平編碼表如表1所示。

表1 響應面分析因子與水平編碼Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

1.3.5 驗證試驗

根據響應面實驗結果，按照最佳制備工藝條件進行脂質體制備，實驗平行3次，取平均值，與預測值進行比較[16]。

1.3.6 掃描電鏡觀察枸杞多糖脂質體結構[17]

將枸杞多糖脂質體冷凍干燥粉碎后真空鍍金70 s，用掃面電鏡通過不同的分辨率觀察枸杞多糖脂質體表面和晶體結構。

2 結果與分析

2.1 枸杞多糖脂質體制備單因素實驗分析

2.1.1 藥脂比對包合率的影響

在膜材比為4∶1，水化溫度40 ℃，藥脂比為1∶10、 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60時進行脂質體制備，得到藥脂比與包合率的關系，如圖1所示，得出枸杞多糖脂質體制備過程中包合率在藥脂比1∶30為轉折點，所以藥脂比應該選擇1∶20、1∶30、1∶40三個水平。

圖1 藥脂比對包合率的影響Fig.1 Effect of lipid ratio on entrapment efficiency

2.1.2 膜材比對包埋率的影響

在藥脂比為1∶10，水化溫度為40 ℃，按照不同的膜材比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1進行包埋，得到膜材比與包埋率的關系。如圖2所示，得出枸杞多糖脂質體制備過程中包合率在膜材比4∶1為轉折點，所以膜材比應該選擇3∶1、4∶1、5∶1三個水平。

圖2 膜材比對包合率的影響Fig.2 Effect of membrane ratio on entrapment efficiency

2.1.3 水化溫度對包埋率的影響

在膜材比為4∶1，藥脂比為1∶10，水化溫度為20、30、40、50、60、70 ℃時進行包埋，得到水化溫度與包合率的關系。如圖3所示，得出枸杞多糖脂質體制備過程中包合率在水化溫度40 ℃為轉折點，所以水化溫度應該選擇30、40、50 ℃三個水平[18]。

圖3 水化溫度對包合率的影響Fig.3 Effect of temperature on entrapment efficiency

2.2 枸杞多糖脂質體制備的響應面實驗分析

2.2.1 響應值結果及其擬合模型

采用Box-Behnken設計方案得到實驗設計及結果如表2所示。

應用響應面法優化枸杞多糖脂質體的制備工藝，以膜材比、藥脂比、水化溫度為單因素進行響應面優化，可得到下列實驗結果，如表3所示。通過回歸方程分析可以得到3個因素與枸杞多糖脂質體制備工藝的包合率之間的多元二次編碼回歸方程為：

Y=70.00+1.00A-1.38B+3.38C-0.25AB+1.75AC-1.00BC-3.75A2-5.50B2-6.00C2

表2 試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the developed regression model

注：**表示差異極顯著(p<0.01)。

方差分析見表3，從回歸方程的一次項系數絕對值中可以得出以下結論：3個因素對包埋率的影響程度大小分別為C(水化溫度)>B(膜材比)>A(藥脂比)[18]。

二次項A2，B2，C2對于枸杞多糖脂質體制備中的包合率的影響具有極顯著性。響應面實驗結果得出最優工藝是藥脂比為1∶32.15、膜材比為3.84∶1、水化溫度為43.26℃時，得到枸杞多糖脂質體的包埋率理論上能達到70.766 9%。

2.2.2 等高線圖和響應曲面圖分析

由圖4、圖5可知，隨著藥脂的比例增加包含率也在逐步上升，當藥脂比達到1∶30左右時包含率達到最大值。可能為相同脂質材料在相同條件下所形成的脂質體膜和包合條件相同，隨著藥物濃度的增加，更多的藥物被包合在脂質體膜中。但是當濃度繼續增加時，包合多糖的能力達到飽和，而未包合的多糖分子增加，繼而包合率下降。

圖4 藥脂比、膜材比對包合率的影響Fig.4 Effect of lipid ratio and membrane ratio on entrapment efficiency

圖5 藥脂比、水化溫度對包合率的影響Fig.5 Effect of lipid ratio and temperature on entrapment efficiency

由圖4、圖6可知，當其他條件一定時，膜材比與包合率的關系是隨著膜材比的變化包合率向增大后減小，膜材比在4∶1左右時包合率達到最大。大豆卵磷脂決定脂質體的數量而膽固醇決定大豆卵磷脂的成膜性，故實驗中固定大豆卵磷脂用量，改變膽固醇用量[19]。6∶1的膜材比使只有少量的大豆卵磷脂成為脂質體，隨著膽固醇量的增加更多的大豆卵磷脂形成脂質體，4∶1左右包合率達到最大，但是隨著膽固醇接著增加脂質體成膜性變差，包合率減小。

圖6 膜材比、水化溫度對包合率的影響Fig.6 Effect of membrane ratio and temperature on entrapment efficiency

由圖5、圖6可知，溫度對包合率的影響是隨著溫度升高包合率變大，直至40 ℃左右包合率達到最大，之后溫度增加包合率降低。包合是一種放熱過程，從低溫度到高溫度的過程的變化是先溫度升高使分子運動加劇，利于整個包合過程。但是40 ℃左右后溫度的增加使逆反應增加，不利整個包合過程，包合率降低。

由響應面圖可知藥脂比、膜材比和水化溫度對包合率均呈現不同的影響作用，或相互交叉性影響[18]。如膜材比和藥脂比之間，當膜材比一定時，包合率隨著藥脂比的變化先增大后減小，當藥脂比處于1∶30附近包合率較大；同樣當藥脂比不變時，隨著膜材比的變化呈現出先增大在減小的趨勢，說明膜材比在4∶1附近最為合理。圖中顯示出坡面趨勢變化較大，說明膜材比與藥脂比之間交叉影響較大。

2.3 驗證試驗分析

把響應面法分析得出的枸杞多糖脂質體制備工藝的最佳工藝條件結合實際可操作條件，選取藥脂比1∶32，膜材比4∶1，水化溫度43 ℃條件下進行3組平行試驗，所選條件比預測條件稍低，得出實際包埋率略低于預測值，相對誤差值0.95%。

2.4 掃描電鏡觀察結果

圖7給出了枸杞多糖表面和晶體結構的電鏡照片， 圖7-A、圖7-B中掃描尺寸1 μm×1 μm，顯示卵磷脂或脂質體沉積在枸杞多糖表面形成非晶體結構。在圖7-C、圖7-D掃描尺寸2 μm×2 μm中可觀察到表面形成一些較為粗糙的類球形顆粒，部分可見雙分子膜結構，屬于單室脂質體[19-20]。

圖7 電鏡掃描結果枸杞多糖脂質體(A,B)掃描尺寸2 μm×2 μm，枸杞多糖脂質體(C,D) 掃描尺寸1 μm×1 μmFig.7 Scanning electron micrograph of lycium barbarum polysaccharide liposome

3 結論

脂質體具有眾多輸送載體無法比擬的優點，但在實際應用中仍存在一定的局限，主要表現在脂質體對酸、熱等敏感，在貯藏期間易聚集融合、絮凝，導致芯材泄漏[20-23]。因此，脂質體作為功能因子輸送載體在應用受到限制。如何在維持脂質體載體系統自身優勢的前提下，進一步增強其對體內、外環境的耐受性，對于拓寬脂質體在實際生產中的應用具有重要意義[24-26]。

本實驗選用天然磷脂作為主要壁材，針對枸杞多糖構建安全有效的脂質體輸送體系，采用薄膜分散水化法進行脂質體的制備，為水溶性不穩定天然藥物制備成脂質體的可行性研究提供理論指導。運用響應面設計構建單因素和包合率數學模型。實驗中考察不同因素水平對枸杞多糖脂質體的制備工藝。通過3因素3水平的響應面實驗設計得出，枸杞多糖最佳脂質體制備工藝為藥脂比1∶32.15、膜材比3.84∶1、水化溫度43.26 ℃時，得到枸杞多糖脂質體的包合率理論上70.77%。相對誤差為0.95%。本研究對于以枸杞多糖為代表的親水性功能因子輸送載體的可控構建具有一定的實踐意義。

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