三孢布拉霉發酵生產類胡蘿卜素的產業化關鍵點探討

范超，洪皓，李妍，吳文忠

(大連醫諾生物股份有限公司，遼寧 大連，116600)

三孢布拉氏霉菌屬于藻狀菌綱，毛霉目，笄霉科，布拉氏霉屬。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上呈棉絮狀，菌叢高約2 ～5 mm，起初白色，后呈淺橙黃色。該菌可產生β-胡蘿卜素，在動物體內可以轉化為VA[1]。另外，在三孢布拉氏霉菌發酵過程中添加番茄紅素環化酶抑制劑，可以阻斷β-胡蘿卜素的產生，從而得到番茄紅素[2]。在歐盟關于食用色素純度標準中，已經將三孢布拉霉作為唯一可用的產生β-胡蘿卜素和番茄紅素的微生物源[3-4]。目前國內外對三孢布拉霉已經進行了比較深入的研究，發酵培養三孢布拉霉來合成β-胡蘿卜素、番茄紅素已經實現了工業化生產。

1 色素及其生物合成

1.1 天然番茄紅素和β-胡蘿卜素

番茄紅素的結構包括全反式、5-順式、7-順式、9-順式、13-順式、15-順式等[5]。β-胡蘿卜素有全反式和9-順式兩種結構。化學合成的β-胡蘿卜素為全反式β-胡蘿卜素，而天然的β-胡蘿卜素含有兩種同分異構體。有研究表明，高劑量化學合成的β-胡蘿卜素(27 mg/kg)誘導會增加小鼠骨髓細胞的微核率(MNF)和畸變細胞率(ACR)，有致癌的可能性，而天然β-胡蘿卜素不具有此影響[6]。天然番茄紅素和β-胡蘿卜素主要源于植物，受自然環境和地域等因素限制，而三孢布拉氏霉菌以其產生的β-胡蘿卜素和番茄紅素具有天然性，并且有發酵周期短、成本較低等優勢，已經成為目前生產β-胡蘿卜素和番茄紅素的主要來源。

1.2 β-胡蘿卜素合成途徑及關鍵基因

國內外學者已經對三孢布拉氏霉菌的類胡蘿卜素生物合成途徑進行了比較系統、深入的研究(圖1)。HU等對三孢布拉氏霉菌合成類胡蘿卜素途徑中的關鍵酶及其作用進行了闡述。hmgR、carRA和carB是類胡蘿卜素合成途徑中3個關鍵酶的編碼基因。hmgR編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)，carRA有2個基因位點R和A，分別編碼番茄紅素環化酶和八氫番茄紅素合成酶，carB基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶，并且通過實驗證實了在三孢布拉氏霉菌發酵過程中添加花生四烯酸可以提高類胡蘿卜素產量，提高hmgR、carRA和carB基因轉錄水平[7]。

圖1 β-胡蘿卜素的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of β-carotene

1.3 番茄紅素的積累

由β-胡蘿卜素的生物合成途徑(圖1)可以得知，β-胡蘿卜素是在番茄紅素環化酶的作用下，由番茄紅素兩端環化而成。如需積累番茄紅素，則需要添加特定的物質阻斷番茄紅素向β-胡蘿卜素方向的合成。2-(4-硫代氯苯基)三乙胺、α-甲基吡啶、咪唑等可以抑制β-胡蘿卜素的生成，促進番茄紅素和γ-胡蘿卜素的生成[8]。MANTZOURIDOU等對近40年內報道的文獻進行了分析，總結出一些吡啶衍生物和咪唑衍生物也可以阻斷β-胡蘿卜素的生物合成，對番茄紅素的積累起到促進作用，這些衍生物包括1-乙基-2甲基咪唑、2-苯基咪唑、2-異丙基咪唑、2-甲基咪唑、1-甲基咪唑、2,6-二甲基吡啶、3-羥基吡啶、2-氨基吡啶、2-甲基吡啶等，其中阻斷作用最為明顯的為2-異丙基咪唑，其阻斷效率可達100%[2]。另外，在培養基中有醋酸維生素A的存在下，添加500 mg/kg的哌啶(Piperidine)也能最大限度地積累番茄紅素，番茄紅素產量為269.66 mg/L，β-胡蘿卜素產量為12.62 mg/L[9]。

2 產業化的關鍵點及解決方案

在三孢布拉氏霉菌生產類胡蘿卜素過程中，菌株的性能、發酵方法、促進因子、色素的保護及反應器類型等是獲得高含量菌絲體的關鍵控制點，提高生產效率和產品收率是制備高純度類胡蘿卜素晶體產業化的關鍵點，因此研究中針對不同控制點提供了相應的解決方案。

2.1 提升菌株性能——誘變及篩選方法

菌株的高產性能是工業化的首要關鍵因素，而獲得高產的菌株通常要通過對菌株進行誘變篩選。傳統的誘變方法包括紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變等。Mehta和Cerdfi-Olmedo采用100 μg/mL的亞硝基胍對三孢布拉氏霉菌NRRL2456 (+)和NRRL2457(-)的孢子進行處理30 min，使孢子的存活率控制在1%。經誘變的菌株類胡蘿卜素產量提高了3～6倍[10]。

三孢布拉氏霉菌除了應用傳統的誘變方法外，還針對其代謝途徑中的相關酶的活性等，選擇性地用相應試劑進行篩選。有專利指出，通過用抗高膽固醇藥物、抗高脂蛋白血癥藥物、降血脂藥、乙酰輔酶A抑制劑、類胡蘿卜素生物合成抑制劑、異戊二烯合成抑制劑(包括甾醇合成抑制劑)等對三孢布拉氏霉菌進行篩選，可以大幅提高其β-胡蘿卜素產量[11]。這些藥物和試劑包括洛伐他汀、普伐他聽、辛伐他汀、乙酰苯胺、制霉菌素、兩性霉素B等。

另外，采用2種或多種誘變方式聯合使用的方法對菌株進行改造也廣泛應用到研究中。WANG等采用N+離子注入聯合亞硝基胍對三孢布拉氏霉菌NRRL 2896(-)進行誘變后，用洛伐他汀和三孢酸粗提物進行篩選，得到突變株I5，其番茄紅素產量比親本提高了64%[12]。另外還有研究采用30% β-胡蘿卜素油懸液和利福平(500 mg/mL)篩選，以及二苯胺聯合煙酸鈉(sodium of nicotinic acid)的篩選方法，獲得突變株β-胡蘿卜素產能由親本的0.011～0.018 kg/(m3·h)提高到0.032～0.041 kg/(m3·h)，提高了3倍～3.5倍，此菌株和生產方法已實現產業化[13]。陳恒雷等采用低能氮離子對三孢布拉氏霉負菌孢子進行輻照，隨著注入劑量的增加，其存活率呈現“馬鞍型”劑量效應曲線，經篩選得到1株β-胡蘿卜素產量達到1.252 g/L的菌株，比出發菌株提高了25%[14]。

2.2 發酵調控方法

2.2.1 培養基組分優化

在三孢布拉氏霉菌的種子培養階段，生長速率和細胞活力是提升的重點，所以這一過程中需要充足的碳源、氮源和生長因子；而在發酵過程中，培養基成分的調整需要更側重于獲得高產量的類胡蘿卜素方面。CHOUDHARI等采用響應面法對發酵培養基的成分和pH條件等進行了優化，使三孢布拉氏霉菌NRRL 2895 (+)和NRRL 2896 (-)聯合培養時的β-胡蘿卜素產量從98 mg/L提高到了139 mg/L[15]。

2.2.2 接種比例

類胡蘿卜素是三孢布拉氏霉菌正負菌在最適的接種比例下才能夠大量積累的，因此以何種比例將正負菌接入到發酵培養基中，是關乎類胡蘿卜素產量的又一關鍵控制點。正負菌菌絲完全結合的理想比例是1∶1，但是由于負菌主要負責產生色素，所以其數量要多于正菌[11]。VARZAKAKOU等研究表明，三孢布拉氏霉菌發酵過程中，正負菌的比例對菌體形態及色素產量有很大的影響，正負菌比例在1∶10～1∶100之間可以得到較高產量的色素[16]。當接種比例為1∶10時色素產量最高，總色素量為175 mg/g，β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素和番茄紅素的產量分別為80%、12%、8%。

2.2.3 色素產量促進因子

2.2.3.1 三孢類化合物及其類似物的添加

三孢類化合物(trisporiods)是β-胡蘿卜素的衍生物，具有18或19個碳原子。其中主要的化合物就是三孢布拉氏霉菌產生的三孢酸[17]。三孢酸是三孢布拉氏霉菌代謝過程中的關鍵因子，是三孢酸A、B、C、D、E這5種物質的混合物(圖2)[18]。有研究證明，使用正負菌混合的培養物與分別使用正負菌的培養物相比，β-胡蘿卜素產量可提高3～20倍[19]。大量研究證實，正負菌株接合時才可產生三孢酸。SCHIMEK等對三孢布拉氏霉菌等菌株產生的三孢類化合物進行了提取、濃縮、純化，并對提取液進行活性檢測，即將10 μL提取液加在長有正負菌菌絲平板上正負菌相交的部分區域，發現該區域有接合菌絲生成，顏色較其他區域深，證實該提取液可以促進菌絲的接合，并能促進色素產量[17]。目前三孢布拉霉合成類胡蘿卜素過程中三孢酸的生物合成途徑仍有很多待研究方面，如代謝途徑中許多基因未找到、相關酶的結構和性質需進一步研究。與此同時，三孢酸對三孢布拉霉合成類胡蘿卜素的具體調控機理尚不清楚，有些學者認為是通過刺激合成途徑中相關酶基因的轉錄來調控，也有人認為是合成途徑中相關酶的合成受其影響[20]。

圖2 三孢酸的結構Fig.2 Structure of trisporic acid

另外，一些三孢酸結構類似物[21]由于與三孢酸有共同的結構骨架(圖3)，在β-胡蘿卜素合成代謝中也能起到比較明顯的促進作用。β-紫羅酮的添加會促進三孢類化合物積累，而三孢酸的含量大大減少，VARZAKAKOU等通過實驗證實，在培養基中添加三孢酸類似物β-紫羅酮對類胡蘿卜素的合成有促進作用[22]。

圖3 三孢酸的功能基團Fig.3 Functional group of trisporic acid

2.2.3.2 表面活性劑

菌株的生長狀態是獲得高產量類胡蘿卜素不可忽視的因素。菌株狀態均一、穩定，以及能否最大限度地從發酵液中攝取營養物質，完全取決于發酵液的狀態。加入表面活性劑是保證發酵液狀態的常用方法。非離子型表面活性劑司班-20在三孢布拉氏霉菌發酵過程中應用最為廣泛。CHOUDHARI等對司班-20、司班-40、吐溫-20、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85和TritonX-100在β-胡蘿卜素發酵中的作用進行了比較，證實了司班-20是最佳的表面活性劑[9]。另外KIM等也證實，在發酵培養基中添加1%濃度的司班-20，使三孢布拉氏霉菌β-胡蘿卜素產量提高了15倍，達到2.3 g/L，同時，三孢酸的含量也提高了15倍，證實了司班-20在一定濃度下可以提高三孢酸的產量，促進β-胡蘿卜素的合成[23]。JEONG等通過實驗證實，在培養基中添加司班-20后，三孢布拉氏霉菌的孢子緩慢生出萌發管，菌絲較短，不易聚成團塊狀，并且發酵3 d后生物量有所增加，菌絲體的色素含量增加20倍[24]。

2.2.3.3 植物油類

有研究表明，三孢布拉式霉菌體內番茄紅素合成的同時，菌株體內的脂質水平也發生了變化。細胞膜上磷脂含量增加了1倍，甾醇和鞘磷脂的含量有輕微變化，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酸含量增加，脂肪酸飽和度增加[25]。在發酵培養基中添加植物油可以促進色素的產量。MANTZOURIDOU等對深層發酵中加入橄欖油和大豆油對類胡蘿卜素的產量影響進行了測試，實驗結果表明，加入10 g/L植物油，對β-胡蘿卜素的產量可以起到14～40倍的促進作用，并且菌體的生長、培養基的狀態、脂質積累以及菌株的退化都與油的濃度相關[26]。VERESCHAGINA等證實，番茄紅素合成的同時，植物油脂肪酸的中性脂質積累，推測添加植物油促進番茄紅素合成的可能機制為菌株體內脂肪酸飽和度增加，使番茄紅素在甘油三酯中的溶解度增加，并提出植物油中亞麻油酸含量是衡量該植物油能否最大限度促進色素產量的關鍵指標[27]。

2.2.3.4 提高溶解氧溶度

三孢布拉氏霉菌發酵產生類胡蘿卜素時嚴格依賴發酵培養基中的溶氧，所以提高培養基中的溶氧濃度在發酵過程中起到重要作用。

MANTZOURIDOU等通過實驗證實，當發酵培養基中的氧傳遞速率在20.5 mmol/h時，β-胡蘿卜素產量能達到最高，為704.1 mg/L；當氧傳遞速率超過20.5 mmol/h時，不利于菌體生長和色素形成，并且確定發酵液中過氧化氫的濃度為2 400 μmol/L時，最有利于色素的合成[28]。另外，JEONG等對過氧化氫在三孢布拉氏霉菌合成類胡蘿卜素中的作用進行了研究，實驗結果表明，在發酵1.5 d時加入10 μmol/L的過氧化氫，可以使β-胡蘿卜素產量提高46%，但是加入高濃度的過氧化氫溶液會使菌體死亡，色素產量下降，而低濃度的過氧化氫起不到促進作用[29]。由此證實在培養基中添加一定濃度的過氧化氫在三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素時可以起到促進作用。

MANTZOURIDOU等還對發酵罐中三孢布拉氏霉菌的菌絲、接合菌囊柄、接合孢子等進行了研究，證實了發酵罐的通氣速度和攪拌速度對菌株的生產能力、生物量、色素產量的影響非常大[30]。當β-胡蘿卜素產量最高達到1.5 kg/m3時，其產率為0.08 kg/(m3·d)，攪拌槳轉速為150 r/min，通氣比為1.5 vvm。

由于氧在某些有機溶劑中的溶解度要大于在水中的溶解度，所以在培養基中添加有機相以提高溶氧也被應用到研究中。FANG XU等通過向發酵培養基中分別添加1%的正己烷和1%正十二烷，使三孢布拉氏霉菌的番茄紅素分別增加了51%和78%，使β-胡蘿卜素產量分別增加了44%和65%[31]。楊曄等通過單因素實驗考察確定發酵過程中添加0.02 mmol/L雙氧水和1.8%正癸烷等，β-胡蘿卜素的產量較對照組提高了77.3%[32]。

2.2.3.5 添加麥角固醇合成抑制劑

麥角固醇是類胡蘿卜素合成過程中的一個副產物，抑制麥角固醇的合成可以促使菌株向番茄紅素和β-胡蘿卜素方向的合成代謝[33]。SUN等在番茄紅素發酵48 h時分別添加0.7 mg/L的鹽酸特比萘酚(TH)和30 mg/L的酮康唑，使番茄紅素的產量分別增加了23%和277%[34]。WANG等通過添加20 mg/L的酮康唑，使麥角固醇的合成代謝減少了76.6%，番茄紅素的合成增加了64.3%[35]。

2.2.4 色素的保護

由于β-胡蘿卜素和番茄紅素是具有很強抗氧化性的物質，在菌體內生成后也必然容易被氧化，所以如何對菌絲體中生成的色素進行保護也是獲得高含量菌絲體必不可少的一步。研究中所使用的抗氧化劑包括抗壞血酸、乙氧基喹啉、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)等[36-37]。

2.2.5 反應器類型

目前常用的生物反應器包括機械攪拌式反應器、氣升式反應器等，在生物發酵中產品收率高、生產能耗低是大型發酵罐的重要經濟指標。機械攪拌式發酵罐是發酵工廠常用類型之一，通過機械攪拌器的作用，有效提供較高的傳質速率和必要的混合速度；其缺點是當發酵液的黏度較高時，機械攪拌器的驅動功率較高，這對大型反應器來說是個巨大的負擔，且機械攪拌形成的強剪切力易打碎三孢布拉霉的絲狀菌絲，造成胞內色素溶出。蔡俊等在100 L機械攪拌發酵罐上發酵培養三孢布拉霉菌144 ～168 h，β-胡蘿卜素含量達到4.8%[38]。LIU等在7 L機械攪拌罐上優化番茄紅素發酵過程中溶氧(DO)、pH和剪切力等因素，并將發酵培養工藝放大到20 L、200 L機械攪拌罐上，番茄紅素含量達到1.76%[39]。與機械攪拌罐相比，氣升式反應器則更適合用于工業上三孢布拉霉菌發酵生產類胡蘿卜素[40]，YEKTA GOKSUNGUR等比較機械攪拌罐和氣升式反應器對三孢布拉霉產β-胡蘿卜素的影響，采用氣升式反應器生產β-胡蘿卜素的最高產量比機械攪拌罐提高了近4倍[41]。由于氣升式發酵罐沒有機械攪拌器，不會產生強剪切力，而三孢布拉霉菌本身是好氧菌，通過空氣壓縮機壓入空氣從而帶動液體流動并實現氣液傳質，發酵過程更易控制，能耗和成本都更低；但其缺點是過高的通氣量易形成氣泛，從而影響氣液傳質速率等，尤其是高黏度培養基。NANOU等研究氣升罐上提高通氣量對三孢布拉霉生產類胡蘿卜素過程中氧化應激壓力和菌絲體形態的影響，通氣量的提高能使菌絲體由大面積聚集變成小面積聚集，且色素產量也有一定程度的提高，當通氣量為4 vvm的條件下胞內β-胡蘿卜素最高含量達到(55.0 ± 2.5) mg/g DCW[42]，他們通過優化培養基使β-胡蘿卜素的含量提高至85.0 mg/g DCW[43]。FANI MANTZOURIDOU嘗試采用氣升罐進行三孢布拉霉的放大培養，以2-甲基咪唑作為環化酶阻斷劑時番茄紅素產量為0.256 g/L[44]。

2.3 提取工藝優化

目前，從三孢布拉氏霉菌中提取純化β-胡蘿卜素的主要工藝包括：菌絲體干燥、細胞破碎、有機溶劑萃取及濃縮等步驟，粗提物通過結晶工藝和進一步的分離純化得到高純度的β-胡蘿卜素晶體產品。整個過程中仍存在工藝復雜、溶劑用量大、效率低、晶體純度和質量難以保證、溶劑交叉使得溶劑回收困難等問題，無論從效率還是成本方面均不利于工業化生產。

邵東等采用二氯甲烷提取β-胡蘿卜素，全過程使用單一溶劑，避免了多種溶劑交叉，生產過程易于控制，產品含量均超過98%，符合USP標準[45]，但二氯甲烷溶劑殘留不易脫除，仍存在較大的食品安全風險。李翔宇等將濕菌體用生物酶與機械破壁結合的方式進行β-胡蘿卜素提取，有效地提高了破壁效率和提取率，菌絲體無需烘干步驟，避免了色素氧化，采用大孔吸附樹脂分離純化β-胡蘿卜素，提取完β-胡蘿卜素的混合油可作為萃取溶劑循環使用，即節約成本又利于環保[46]。范超等同樣使用濕菌體進行β-胡蘿卜素提取，省去菌體干燥步驟，節約能耗同時避免了色素含量下降，采用機械破壁的同時利用乙酸乙酯進行提取，菌絲體破壁效果好且提取率高達95%以上，提取溶劑回收方便，產品溶劑殘留低，符合國標要求，通過兩步結晶工藝，無需重結晶或洗滌，保證晶體的高純度和高收率，整體工藝簡單、流程短、損失少、成本低，易于實現工業化生產[47]。

3 工業化狀況及展望

采用三孢布拉氏霉菌發酵方法生產出的色素具有產品天然、周期短、產率高等特點，已經實現了工藝化，解決了植物提取方法獲得色素所體現出的原料季節性短缺以及成本高的問題。在國際市場上，主要以德國巴斯夫集團和烏克蘭VITAN Group (被以色列LYCORED公司收購)的發酵技術最為成熟，并率先實現工業化。國內對于三孢布拉氏霉菌的研究多數局限于各高校和研究所的實驗室中，工業化進程相對較慢。江蘇省微生物研究所有限責任公司是國內第一家用發酵法生產番茄紅素的企業，但其番茄紅素粉劑年產量僅為12 t，在12 t發酵罐中的生產水平為0.9 g/L，該數據較目前報道的搖瓶發酵水平尚有一定差距，可見該項目在工業化中仍有亟待解決的難題。

β-胡蘿卜素和番茄紅素以其具有的天然抗氧化、抗腫瘤、著色性能等，已經廣泛應用于醫藥、食品、飼料添加劑、化妝品等各個領域，其應用形式包括油懸液、Beadlets微粒、CWS微囊粉等，目前國內具有生產該形式產品技術的公司主要有大連醫諾生物有限公司和浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠等。隨著人們對健康食品需求的不斷增大，類胡蘿卜素市場需求量每年以3.5%的速度在增長，國內三孢布拉氏霉菌發酵工業化進程需要加快，各種形式產品的生產技術需要不斷提高，而這些研究將帶來巨大的經濟價值，并能提升國內產品在國際相關領域中的競爭力。

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