傳統(tǒng)方法與分子生物檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)核病的比較研究

喬相練

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致，是傳染性疾病，在世界范圍內(nèi)具有高發(fā)生率和死亡率，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重化的威脅。隨著防治結(jié)核病工作的開(kāi)展，我國(guó)結(jié)核病疫情得到有效的控制，發(fā)病率下降，但近年來(lái)，有些地區(qū)的結(jié)核病發(fā)生出現(xiàn)了回升趨勢(shì)，引起了學(xué)者的高度重視[1]。作為重點(diǎn)防治的傳染病，結(jié)核病的早期防治主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷，發(fā)現(xiàn)傳染源，確診結(jié)核病，實(shí)施治療。結(jié)核病傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是痰中結(jié)核桿菌檢測(cè)，做痰涂片和痰培養(yǎng)，但由于周期較長(zhǎng)，不能滿足臨床需要[2]，因此，需要一種新的檢測(cè)方法。本文選取2016年1月～2017年1月在本院就診的疑似結(jié)核病90例患者，對(duì)比分析了傳統(tǒng)檢測(cè)方法和分子生物檢測(cè)方法，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月～2017年1月在本院就診的疑似結(jié)核病患者90例作為研究對(duì)象，男50例，女40例，年齡31～74歲，平均年齡（45.4±3.6）歲，入選患者均對(duì)本次研究知情，在參與研究同意書(shū)上簽字。

1.2 方法 儀器：收集90例患者的痰液標(biāo)本，使用儀器是美國(guó)伯樂(lè)CFX96熒光定量PCR檢測(cè)儀，高倍顯微鏡。

標(biāo)本處理：在采集的痰液標(biāo)本中，加入4%NaOH溶液，劑量是痰液的4倍，然后搖勻，在室溫下，靜止放置30 min，液化，取1 ml放入離心管中，在離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)數(shù)是12 000 rpm，去除上清液，沉淀后，加入1 ml無(wú)菌生理鹽水，打勻，再次放入離心機(jī)中離心5 min，轉(zhuǎn)數(shù)是12 000 rpm，重復(fù)洗滌2次[3]。沉淀后加入50μDNA提取液，充分混合均勻后，提取液體中與水不相溶的物質(zhì)，提取過(guò)程需要使用加樣器充分混合均勻后進(jìn)行[4]。若出現(xiàn)吸管頭嘴太細(xì)不能吸取或堵塞吸頭，要使用未被污染的，將吸管頭嘴部減去一段，然后實(shí)施金屬浴10 min，離心5 min，12 000 rpm。

檢測(cè)方法：所有標(biāo)本均使用濃縮集菌涂片抗酸染色顯微鏡檢查，熒光定量PCR檢測(cè)。方法是取單份PCR反應(yīng)管，將處理后的保本直接加入其內(nèi)，8 000 rpm離心5 s，將反應(yīng)管放入PCR檢測(cè)儀中，擴(kuò)增，在93℃下2 min預(yù)變性，再93℃45 s，55℃120 s，做30個(gè)循環(huán)后放入33℃環(huán)境中保溫，PCR反應(yīng)后熒光監(jiān)測(cè)，在PCR試管充分的冷卻到33℃，迅速將擴(kuò)增后的反應(yīng)管放入熒光檢測(cè)儀中，讀取并記錄，熒光激發(fā)波長(zhǎng)是487 mm，檢測(cè)波長(zhǎng)是525 mm。

質(zhì)量控制：陰性質(zhì)控品的增長(zhǎng)曲線未表現(xiàn)出S型，或者Ct值是空白，陽(yáng)性質(zhì)控品的增長(zhǎng)曲線表現(xiàn)出S型，且強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品定量參考值為1×102基因拷貝/ml至2×104基因拷貝/ml。

結(jié)果判斷：陰性是定量值＜5.000E+02，陽(yáng)性是定量值＞5.000E+02。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

傳統(tǒng)方法的痰涂片檢查診斷陽(yáng)性56例，陽(yáng)性率62.2%，分子生物檢測(cè)方法的熒光定量PCR診斷陽(yáng)性74例，陽(yáng)性率82.2%，傳統(tǒng)方法的痰涂片檢查陽(yáng)性率低于分子生物檢測(cè)方法的熒光定量診斷陽(yáng)性率，兩種檢測(cè)方法存在差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.792，P=0.002）。且分子生物檢測(cè)方法的熒光定量PCR與痰涂片陽(yáng)性符合率為75.6%（56/74），見(jiàn)表1。

表1 傳統(tǒng)方法與分子生物檢測(cè)方法對(duì)比Table 1 Comparison of traditional methods and molecular biological detection methods

3 討論

結(jié)核病是結(jié)核桿菌引起的慢性傳染性疾病，是一種全球性疾病，近年來(lái)，結(jié)核病的發(fā)病率呈現(xiàn)出再次升高的趨勢(shì)，給全球結(jié)核病的防治提出了新的挑戰(zhàn)。由于感染結(jié)核桿菌后沒(méi)有明顯的癥狀或體征，僅PPD試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，因此，結(jié)核病的診斷成為了臨床研究的重點(diǎn)，是結(jié)核病防治工作的重點(diǎn)。以往，對(duì)于結(jié)核病的診斷，主要是根據(jù)患者的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果確診，但由于一些患者的結(jié)核病無(wú)明顯癥狀體征，從而給臨床診斷帶來(lái)了一定的難度。實(shí)驗(yàn)室對(duì)于結(jié)核病的診斷主要是根據(jù)細(xì)菌學(xué)涂片和痰培養(yǎng)。痰涂片檢查方式不僅能夠明確結(jié)核病的傳染源，而且檢查費(fèi)用低廉，符合我國(guó)的國(guó)情，但檢出陽(yáng)性率偏低，進(jìn)而失去了診斷的準(zhǔn)確性，但在當(dāng)前結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢查中，痰培養(yǎng)仍是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，特別是藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)患者的臨床用藥和耐藥性檢測(cè)等方面起到了重要作用，不過(guò)檢測(cè)時(shí)間加長(zhǎng)，因此，需要改進(jìn)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核病分子流行病學(xué)的研究，耐藥性的研究新技術(shù)的建立，分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病研究中廣泛的應(yīng)用，PCR技術(shù)已經(jīng)在結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷中開(kāi)展應(yīng)用[5]。PCR技術(shù)是利用一對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，一條結(jié)核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶，四種核苷酸單體等成分，體外擴(kuò)增發(fā)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌[6-7]。

分子生物檢測(cè)方法中的熒光定量PCR技術(shù)的實(shí)施是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的累積，監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)缺陷測(cè)定樣品中的DNA進(jìn)程，1 d內(nèi)即可得出檢驗(yàn)結(jié)果[8-9]。由于PCR擴(kuò)增是在密閉的狀態(tài)下進(jìn)行，從而避免了擴(kuò)增物的污染，減少了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，靈敏度和特異性較高[10]。

本次研究中收集了90例疑似患者的痰液標(biāo)本，對(duì)比傳統(tǒng)方法和分子生物檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法的痰涂片檢查診斷陽(yáng)性率62.2%，分子生物檢測(cè)方法的熒光定量PCR診斷陽(yáng)性率82.2%，兩種檢測(cè)方法存在差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，在結(jié)核病的檢測(cè)中，分子生物檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，具有較高的診斷和鑒別診斷價(jià)值，適合在臨床推廣應(yīng)用。

[1] 李強(qiáng),夏輝,歐喜超,等.應(yīng)用線性探針技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)耐藥結(jié)核病的成本比較[J].中國(guó)防癆雜志,2013,35(3):187-190.

[2] 趙琪林.三種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病診斷價(jià)值的比較研究[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué),2012,16(3):85-86.

[3] 李榮輝,羅又瑋.4種檢測(cè)方法在診斷結(jié)核病中的價(jià)值分析[J].臨床合理用藥雜志,2016,9(23):96-98.

[4] 馮玉敏.結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法學(xué)比較及進(jìn)展[J].中國(guó)城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2015,30(4):29-31.

[5] 王震,龔玉華,錢彩娣,等.5種結(jié)核桿菌檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,12(3):334-336.

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[8] 高孟秋,劉菲,紀(jì)濱英,等.兩種?-干擾素釋放分析在結(jié)核病臨床診斷中的比較研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2012,35(10):762-765.

[9] 陳雪林,崔嘉,劉宇,等.兩種全血?-干擾素釋放試驗(yàn)試劑盒在結(jié)核病診斷中的比較研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2013,6(24):11380-11383.

[10]鮑磊,李濤,盧水華.全血?干擾素釋放試驗(yàn)在兒童和成人中的結(jié)核病診斷價(jià)值[J].微生物與感染,2014,9(1):21-27.