PCR方法快速鑒別食品中肉的種類(lèi)

岳鵬 王安 杜欣悅 王斌

在我國(guó)食品行業(yè)中，有很多生產(chǎn)廠家為了提高經(jīng)濟(jì)效益，使用低質(zhì)肉冒充優(yōu)質(zhì)肉，欺騙消費(fèi)者。而且隨著全球化的進(jìn)一步推進(jìn)，不同民族和宗教的人們?cè)陲嬍沉?xí)慣方面有很大的不同，比如伊斯蘭教和我國(guó)回族都不吃豬肉。所以食品中肉類(lèi)的鑒別成為人們關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題，食品行業(yè)常用的肉類(lèi)鑒別方法有傳統(tǒng)的免疫學(xué)鑒別方法與理化鑒別方法、高新的PCR檢測(cè)方法以及HPLC鑒別方法。本文主要對(duì)PCR方法進(jìn)行分析。

PCR方法快速鑒別食品中肉的實(shí)驗(yàn)

材料、儀器與樣品處理。筆者在本地市場(chǎng)選購(gòu)了羊肉、雞肉和牛肉等多種類(lèi)型食品；實(shí)驗(yàn)所需的Taq DNA聚合酶、DL2000 marker以及DNA分子量標(biāo)記全部由某生物工程企業(yè)提供。實(shí)驗(yàn)所用的儀器有PCR熱循環(huán)儀、核算蛋白分析儀以及凝膠成像系統(tǒng)等。

為了便于實(shí)驗(yàn)，筆者將購(gòu)買(mǎi)的食品進(jìn)行獨(dú)立取樣之后，進(jìn)行粉碎處理，并取5g樣品溶解于30mL預(yù)熱過(guò)的裂解緩沖液中，采用渦旋振蕩方式振蕩十五分鐘，形成均質(zhì)的溶液，并在室溫下（25℃- 27℃）放置四十五分鐘，每隔十五分鐘進(jìn)行五分鐘的渦旋振蕩，然后至于4℃的恒溫箱中過(guò)夜，確保樣品充分裂解。

將過(guò)夜之后的樣品進(jìn)行三分鐘的渦旋振蕩，放置十分鐘使其顆粒沉降，將上層清液轉(zhuǎn)移到1.5mL的Eppendorf管中，防止Eppendorf管出現(xiàn)破裂或者變形現(xiàn)象，需要將多個(gè)樣品管對(duì)稱(chēng)且均勻地?cái)[放在微波臺(tái)上，進(jìn)行一到三分鐘的微波加熱，還需要在微波室內(nèi)放置一杯蒸餾水，避免試驗(yàn)樣品的溫度過(guò)高，一般來(lái)說(shuō)，微波處理之后的樣品溫度應(yīng)在75℃到80℃之間；按照13000r/min的速率進(jìn)行五分鐘的離心，吸取上層清液到新的離心管中，該液體就是DNA模板溶液；將DNA模板溶液放置在核算蛋白分析儀中，測(cè)定模板溶液在260nm處的吸收值。

實(shí)驗(yàn)方法。首先，PCR檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物基因組的線(xiàn)粒體DNA含有非常多的拷貝數(shù)，還具備一定的抗腐蝕性，所以筆者將不同動(dòng)物的線(xiàn)粒體基因序列作為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出帶有豬、羊、雞和牛的特點(diǎn)的引物。本次試驗(yàn)選用Taq DNA聚合酶在25μL的反應(yīng)體系下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在該體系中，MgCl2為2.5μL、上下游的引物均是0.5μL，Taq DNA聚合酶為 0.3μL、模板DNA在30- 50ng，并使用滅菌之后的雙蒸水將體積補(bǔ)充到25μL。在94℃溫度下進(jìn)行預(yù)變性五分鐘之后，按照94℃ 30s、退火遵循58/56/55/59℃ 30s、在72℃延伸30s的順序，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)的72℃延伸需要進(jìn)行十分鐘，并將PCR產(chǎn)物置于4℃進(jìn)行保存。

然后，瓊脂糖凝膠電泳。將PCR檢測(cè)所得的PCR產(chǎn)物放在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。電泳的電壓為80V，選擇的分子量標(biāo)記是DL2000 marker，仔細(xì)觀察電泳的結(jié)果并拍照記錄。

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者選用豬肉成分檢測(cè)作為對(duì)照，將豬肉按照50%、20%、5%、0.5%以及0.1%（m/m）的比例均勻添加到大豆制品中，使用上述樣品處理以及試驗(yàn)方法進(jìn)行肉的種類(lèi)的鑒別。鑒別的結(jié)果顯示，除了0.1%豬肉比例的大豆制品，其余食品中的豬肉均能夠檢出基因片段，說(shuō)明本文使用的鑒別方法能夠鑒別肉比例大于0.5%的食品中肉的種類(lèi)。而且本文設(shè)計(jì)的引物敏感性比較高，能夠用于食品中肉類(lèi)的鑒別。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

筆者共購(gòu)買(mǎi)了五十份食品，觀察電泳的結(jié)果可知，共有五份食品中檢測(cè)出149bp的豬線(xiàn)粒體基因序列，說(shuō)明其中含有豬肉成分；共有七份食品中檢測(cè)出269bp的牛線(xiàn)粒體基因序列，說(shuō)明其中含有牛肉成分；共有五份食品中檢測(cè)出290bp的羊線(xiàn)粒體基因序列，說(shuō)明其中含有羊肉成分；但是未檢測(cè)出含有雞肉成分。筆者將PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增片段送到測(cè)序公司進(jìn)行了測(cè)序，并將其與動(dòng)物的基因組序列進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比的結(jié)果和電泳的結(jié)果相同。因此，本文所用的PCR方法能夠進(jìn)行食品中肉的種類(lèi)的鑒別。

綜上所述，PCR方法能夠準(zhǔn)確且快速地鑒別食品中的肉類(lèi)成分，值得推廣應(yīng)用。通過(guò)對(duì)PCR方法的分析可知，本文通過(guò)微波加熱的方法進(jìn)行食品樣品DNA的提取，具備較強(qiáng)的適用性以及創(chuàng)新性，能夠用于復(fù)雜肉類(lèi)成分的食品鑒別，而且PCR方法的鑒別效率非常高，可以將其拓展到其他領(lǐng)域。本文的分析仍舊存在不足，僅供參考。