肺癌活檢標本的免疫組化檢測在非小細胞肺癌鑒別診斷中的目的及意義

古麗那爾·阿布拉江，劉銘新疆醫科大學第一附屬醫院病理科，新疆烏魯木齊 830054

近年來，因人們充分意識到煙草對身體的危害性，國家有關部門開展了全面控煙的工作，據有關調查數據顯示，美國在近20年當中因肺癌致死的病例顯著減少，可盡管如此，肺癌依舊是年齡＞40歲的男性死亡的一個重要原因[1]。現階段，我國的肺癌發病率依舊較高，而該病作為一種惡性腫瘤類疾病，不僅嚴重損害了患者的身心健康，同時也增加了患者死亡的風險[2]。對于首診明確為肺癌的患者，當中約有66.67%處于肺癌晚期，大部分患者只能獲取到細針穿刺亦或者是活檢小標本[3]，且在這些標本當中，非小細胞癌組織學分型不明確的有30%～50%[4]。醫療技術的發展，在當今這種分子靶向治療時代，促使對組織學分型提出了更高的要求，WHO推薦將免疫組織化學檢測積極用在肺癌組織的分型當中[5]。該次研究，將以360例非小細胞肺癌活檢標本（收集于2016年1月—2017年12月）為對象，著重探討肺癌活檢標本的全自動免疫組織化學檢測在鑒別診斷非小細胞肺癌中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便收集該院接診且經病理學以及臨床檢查證實為肺鱗狀細胞癌或腺癌活檢標本360例，其中男性患者193例，女性患者167例；年齡33～76歲，平均（61.24±10.15）歲；腺癌患者201例；鱗癌患者159例。所有患者在檢查前都沒有接受過靶向治療亦或是放化療，且知情同意該研究，獲得醫院倫理委員會批準，所有病例臨床資料齊全。

1.2 方法

①標本處理：所有來源于支氣管活檢、針刺活檢及手術切除標本，離體后立即浸入固定液，并送往該科進行病檢。標本經10%中性緩沖福爾馬林固定，全自動組織脫水機常規處理及石蠟包埋，3 μm厚度連續切片，常規HE染色，由2名高年資病理診斷醫師進行切片觀察。

②免疫組織化學：常規3～4 μm連續切片，37℃烤片過夜。采用免疫組化EnVision二步法，陰性對照采用PBS取代一抗，陽性對照則選用已知陽性片。組織切片經二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后，進行EDTA抗原熱修復，滴加需檢測的標記 p63、TTF-1、CK5/6及 CK7一抗，37℃孵育1～2 h，PBS洗滌，滴加DAKO公司提供的，以辣根過氧化物酶 （HRP）為標記的通用型二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色約5～10 min （鏡下控制染色），蘇木素復染細胞核，鹽酸酒精分化，組織藍化，最后進行脫水、透明，中性樹膠封片及鏡檢。

③結果判斷：p63和TTF-1主要在細胞核表達，CK5/6主要在胞膜以及胞質中表達，Napsin A主要在胞質中表達。根據陽性細胞數和著色強度進行判讀，詳細如下：0分，著色強度分提示無色；1分，淺黃色亦或者是黃色；2分，棕黃色。0分，提示陽性細胞數分＜10%；1分，10%～50%；2分，＞50%。若上述2項結果的成績≤2分，即可判定為陰性；若＞2分，即可判定為陽性[6-7]。

1.3 統計方法

數據以SPSS 20.0統計學軟件分析，以[n（%）]表示計數資料，經χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性表達情況評價

鱗癌組的p63表達陽性率為91.82%、CK5/6表達陽性率為94.34%，均明顯比腺癌組的6.47%、7.46%高，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。腺癌組的TTF-1表達陽性率為92.04%、Napsin A表達陽性率為97.01%，均明顯比鱗癌組的5.03%、0.63%高，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 1。

表1 肺癌活檢標本免疫組化檢測的陽性表達情況分析[n（%）]

2.2 特異性以及敏感性評價

在肺癌活檢標本的免疫組化檢測中，Napsin A和TTF-1陽性表達對中低分化腺癌進行診斷的敏感性依次為97.01%、75.24%，特異性依次為92.04%、91.82%。而p63與CK5/6陽性表達對中低分化鱗癌進行診斷的敏感性依次是70.15%、90.26%，特異性依次是63.57%、76.29%。

3 討論

肺癌是全世界范圍內最常見的癌癥類型，當前在我國其發病率及死亡率均高居癌癥首位。在所有肺癌中80%為非小細胞肺癌，其包括腺癌、鱗癌和大細胞癌。在近幾年，非小細胞肺癌中鱗癌及腺癌的鑒別診斷越來越受到臨床醫學的重視，究其原因主要是因為：①在最近的10年當中，諸多醫學專家和學者對肺癌的分子靶向治療提出了更高的要求，比如：ROS1、EGFR以及ALK等基因活化常常發生于腺癌中，而PD-1單抗Nivolumab則往往獲批于晚期鱗癌中[8]。②貝伐單抗以及培美曲塞等藥物只獲批于非鱗非小細胞肺癌當中，若鱗癌患者應用培美曲塞亦或者是貝伐單抗，將會引發嚴重的不良反應，甚至可以直接導致患者的死亡[9]。由于該種嚴格限制組織學類型藥物在臨床上的廣泛使用，使得臨床明確分型肺癌組織學提出了高要求。

對于首診非小細胞肺癌患者來說，當中有66.67%左右的患者處于肺癌晚期，且大部分患者都能獲取到細針穿刺亦或者是活檢小標本[10]。在21世紀初期，臨床對非小細胞肺癌支氣管內超聲引導針吸活檢法，也就是EBUS-TBNA，進行了應用，此法能通過超聲引導進行穿刺，具有比較高的安全性以及準確性，并在之后的十年中得到了較為迅速的發展。相關資料中有記載，EBUS-TBNA法在診斷肺癌中具有非常高的特異性以及敏感性，能多次重復進行操作，且其標本既能進行常規的病理切片檢查，還能為多種分子生物學分析提供重要依據[11]。由EBUS-TBNA法所獲得的活檢標本，選擇分化較好的鱗癌亦或者是腺癌，能通過HE染色的方式進行確診，針對低分化腫瘤，不能明確其病理組織學亞型的有30%～50%，且其錯判率也在15%～35%的范圍之內[12]。因細針穿刺獲得的小標本中沒有太多的腫瘤細胞，并缺乏典型的組織結構，加之分子靶向治療有著更高的組織學分型要求，所以，如何高效且充分的利用EBUS-TBNA標本完成分子分型以及病理診斷工作，依舊是臨床目前研究的一大重點。現階段，WHO推薦在肺癌組織病理學分型中積極應用免疫組化。此研究結果表明，通過采取EBUS-TBNA法所獲得的小標本都能成功檢測 CK5/6、TTF-1、p63 以及 Napsin A。

諸多研究發現，通過組織病理學進行驗證，對于TTF-1提示陰性且p63提示陰性的患者，明確為非腺癌的特異性非常高，另外，若TTF-1提示陰性而p63提示陽性，則能明確診斷為肺鱗癌，即便是在低分化鱗癌中也具有顯著的特異性。若TTF-1以及p63都提示陽性，那么就應對患者進行CK5/6的檢測，若CK5/6提示陰性且TTF-1/p63為低比值，需考慮鱗癌。現階段，臨床公認的一種腺癌標志物乃TTF-1，而p63則是鱗癌的一種公認標志物。在人體的機體當中，Napsin A乃胃酶樣天冬氨酸蛋白酶，在肺Ⅱ型上皮以及肺腺癌中有表達，且其在肺腺癌中表達的敏感度比表面活性蛋白A、B高，此外，Napsin A也具有非常高的特異性，對于部分TTF-1陰性低分化肺腺癌患者來說，其Napsin A多為陽性。徐曉艷等人[11]的研究表明，在對100例非小細胞肺癌活檢標本進行免疫組化檢測后，68例肺腺癌患者的Napsin A陽性率為97.1%、TTF1陽性率為92.6%，比32例肺鱗癌患者的3.1%、9.4%高，并且，肺鱗癌患者的p63陽性率為8.8%、CK5/6陽性率為7.3%，比肺鱗癌患者的93.8%、96.9%低，這一結果和該研究具有一定的相似性。該研究中，腺癌患者的Napsin A與TTF1表達陽性率依次是97.01%、92.04%，明顯比鱗癌患者的0.63%、5.03%高，組間差異有統計學意義（P＜0.05）；鱗癌患者的p63與CK5/6表達陽性率依次是91.82%、94.34%，明顯比腺癌患者的6.47%、7.46%高，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，利用免疫組織化學染色法，檢測肺癌活檢標本中p63、TTF1、CK5/6以及Napsin A蛋白表達情況，在鑒別診斷肺鱗、腺癌中具有非常高的特異性以及敏感性。

綜上所述，在非小細胞肺癌的鑒別診斷工作中，即使是有經驗的病理醫師也往往難以做出明確的判斷，因此，積極對肺癌患者的活檢標本進行免疫組織化學檢測，有效提高肺腺癌與肺鱗癌鑒別診斷的準確性，為臨床科室提供重要的參考依據，值得推廣使用。

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[2]田亮,郭效忠,苗志剛,等.聯合免疫標記物在非小細胞肺癌中的表達及意義[J].診斷病理學雜志,2017,24(9)：693-696.

[3]趙丹,尹春嶺,王重利,等.細胞角蛋白7、甲狀腺轉錄因子1、新天冬氨酸蛋白酶A、細胞角蛋白5/6、p40、p63在肺腺癌及鱗狀細胞癌鑒別診斷中的價值[J].中國綜合臨床,2015,31(7)：593-596.

[4]張愛麗,孫宇,徐少艷,等.免疫組化在肺小活檢中對鱗狀細胞癌和腺癌的鑒別診斷意義[J].診斷病理學雜志,2016,23(1)：70-73.

[5]李璽,榮福,陳堅平,等.非小細胞肺癌EBUS-TBNA標本中TTF-1、CK7、CK5/6和 p63的表達及其意義[J].國際呼吸雜志,2016,36(22)：1691-1694.

[6]沈勤,王璇,余波,等.手工免疫組化檢測非小細胞肺癌 ALK蛋白表達的對比分析[J].臨床與實驗病理學雜志,2015(3)：268-272.

[7]顧霞,吳潔瑜,何新明,等.手工免疫組化法檢測ALK融合蛋白在非小細胞肺癌中的表達[J].南方醫科大學學報,2015,35(10)：1440-1445.

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[9]ZHANG Zhen-fa,PEI Bao-xiang,WANG An-lei，et al.Expressions of CLDN1 and insulin-like growth factor 2 are associated with poor prognosis in stage N2 non-small cell lung cancer[J].中華醫學雜志：英文版,2013,126(19)：3668-3674.

[10]王杰,劉暢,鐘殿勝，等.免疫組化法檢測 NSCLC患者EGFR突變的相關研究[J].中國肺癌雜志,2015,18(4)：212-218.

[11]徐曉艷,杜華,寶魯日,等.非小細胞肺癌活檢標本中CK7、TTF-1、NapsinA、CK5/6及 p63 的表達及其意義[J].診斷病理學雜志,2015,22(11)：688-691.

[12]Lin Yang,Yun Ling,Lei Guo，et al.Detection of ALK translocation in non-small cell lung carcinoma (NSCLC)and its clinicopathological significance using the Ventana immunohistochemical staining method：a single-center large-scale investigation of 1,504 Chinese Han patients[J].中國癌癥研究：英文版,2016,28(5)：495-502.