G.41×新疆野蘋果樹體生長性狀的QTL精細定位及候選基因預測

董軍，王京，梁微，馬百全，董麗娟，馬鋒旺，符軒暢，李翠英

（西北農林科技大學園藝學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100）

0 引言

【研究意義】蘋果作為世界上最重要的溫帶水果之一，實現高產是蘋果育種的主要目標之一[1-2]。矮化砧木被證實可以顯著減小地上部的樹體大小、提高成花率，增加單位面積內果實產量[3-4]。矮化砧木是通過誘導地上部形成良好的樹體結構，從而實現蘋果豐產、穩產的目的[5]。但是，蘋果屬植物大多屬于多年生木本植物，生長周期長，遺傳高度雜合，在一定程度上阻礙了蘋果砧木育種研究[6]。蘋果砧木育種主要依靠常規育種方法，常規育種方法周期長、效率低，這些也嚴重制約了蘋果砧木育種進程的發展[7-9]。因此，如何縮短蘋果砧木的育種周期和提高育種效率，成為育種工作者長期的主要目標。【前人研究進展】關于蘋果砧木誘導地上部生長相關的QTL早有報道。一些形態學的性狀，例如株高、莖干直徑，已經被證實與蘋果樹體結構相關[10-12]。PILCHER等[13]第一次找到了控制蘋果矮化性狀的Dw1位點，并將該位點定位于‘M.9’第5號連鎖群頂部2.5 cM范圍內。FAZIO等[14]以親本‘Ottawa 3’‘Robusta 5’為試材，證明了Dw1位點的存在，且發現位于11號連鎖群與之互作的Dw2位點。隨后，FAZIO 等[14]以‘Geneva 935’‘Budagovsky 9’為材料，構建了包含1 841個SNP標記的高密度遺傳圖譜，證明Dw1與Dw2位點間的互作，同時在16號連鎖群發現另一個與植株生長相關的微效 QTL。FOSTER等[15]以‘M.9’和‘Robusta 5’為試驗材料，分別在5、11號連鎖群上找到砧木誘導矮化的Dw1位點和Dw2位點，同時在 LG6、LG9、LG10和 LG12上存在 4個較弱的 QTL位點。HARRISON等[16]以‘M432’蘋果砧木作圖群體為試材，找到了3個與根皮率相關的QTL，其中Dw1、Dw2與前人研究一致，Dw3位于13號連鎖群，該文章指出根皮率與蘋果砧木誘導矮化相關，并與接穗直徑呈顯著負相關[16-17]。【本研究切入點】目前，關于蘋果砧木誘導接穗矮化相關基因的精細定位及其調控基因的研究在國內報道較少，相對于玉米[18]、油菜[19]、水稻[20,21]、黃瓜[22]等農作物而言，研究進展緩慢。【擬解決的關鍵問題】本研究以矮化蘋果砧木‘G.41’和喬化蘋果砧木新疆野蘋果為親本構建的F1代為試材，在前人研究的基礎上，利用SSR分子標記技術構建蘋果5號染色體的遺傳圖譜，對生長相關性狀進行精細定位，深入挖掘調控蘋果樹體生長的候選基因。

1 材料與方法

試驗于2014—2015年在西北農林科技大學進行。

1.1 試驗材料

以對接穗品種生長具有顯著差異的蘋果砧木‘G.41’和新疆野蘋果為親本及其雜交F1代188株為試驗材料（‘G.41’為矮化蘋果砧木，新疆野蘋果是在我國廣泛應用的喬化蘋果砧木）。2014年春播種，于4月進行盆栽（250 mm×180 mm），培養土為草炭和表層土以1:2體積比的混合物。于7月取單株幼葉用于DNA的提取。當年9月將接穗‘富士冠軍’嫁接到雜交F1代植株上。2015年7月，對植株的接穗高度、接穗橫截面積等生長性狀進行調查。

1.2 表型數據的調查及分析

參照 HARRISON 等[16]的方法對生長相關性狀進行調查，調查的指標包括：接穗高度（sciont height，SH）、接穗橫截面積（trunk cross-sectional area，TCA）。

接穗高度的測量：利用卷尺對植株高度進行多次測量，求平均值。

接穗直徑的測量：利用數顯電子游標卡尺，測定距離嫁接口以上5 cm位置接穗部分的主干直徑，然后通過圓面積公式 S=πr2計算接穗橫截面積。在同一位置，測量兩次，兩次測量之間呈90度，求取平均值作為最終直徑。

將上述調查表型數據錄入Excel 2010軟件，利用IBM SPSS Statistics 20軟件對其表型數據進行描述性統計和相關性分析。

1.3 SSR標記篩選

參考LODHI等[23]的CTAB法提取兩親本及F1群體各單株基因組DNA。本研究中，基因初步定位使用的 69對 SSR引物來源于蘋果公共數據庫（http://www.hidras.unimi.it/）公布的引物。SSR反應體系為 20 μL：模板 DNA（80 ng·μL-1）1.5 μL，正向、反向引物（10 μm·L-1）各 1.5 μL，TaqDNA聚合酶（500 U，Thermo Fisher Scientific）0.2 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.6 μL，10×PCR Buffer 2 μL，加 ddH20 至 20 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個循環；72℃保溫5 min，4℃保存。

擴增產物用6.0%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳前，PCR產物中加入5 μL 6×loading buffer，置于PCR儀上，94℃，變性 5 min，迅速置于冰上，備用。采用1 400 V恒電壓電泳分離2 h，銀染顯色后在膠片觀察燈下進行帶型統計分析。SSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，500 bp Marker購自廣州東盛生物科技有限公司，其他分子試劑均購自寶鑫試劑公司。

1.4 遺傳圖譜的構建及QTL初步定位

根據“擬測交”策略，利用Joinmap 4.0[24]軟件中CP群體分離模型，構建蘋果遺傳圖譜，作圖函數為Kosambi’s。

應用Map QTL 5.0[25]作圖軟件，在構建的遺傳圖譜基礎上，結合后代F1群體的表型數據，對接穗高度和接穗橫截面積生長性狀進行QTL定位。采用區間作圖方法對 2個生長相關性狀進行分析，當LOD≥2.5時，則認為可能存在與性狀相關的 QTL位點。

1.5 SSR標記開發及精細定位

根據蘋果屬基因組數據庫（https://www.rosaceae.org/species/malus/all）基因組序列信息，確定與生長基因連鎖的兩側翼標記在基因組中的位置，截取相應的基因組序列，利用Microsatellite repeats finder（http://insilico.ehu.es/mini_tools/microsatellites/）在線軟件對獲得的基因組序列進行SSR位點的尋找。具體的參數設置為：二核苷酸（Dinucleotide）重復次數不少于9次；三核苷酸（Trinucleotide）重復次數不少于5次、四核苷酸（Tetranucleotide）重復次數不少于4次。利用Primer Premier 5.0軟件，設計新的SSR引物，其參數主要采用默認值。新設計的引物在上海生工合成，將這些引物多態性進行篩選并對5號染色體遺傳圖譜上的接穗高度和接穗橫截面積相關的 QTL位點進行精細定位。

1.6 候選基因預測

根據精細定位的結果，確定基因預測的區間，一般而言選擇 LOD值高、貢獻率大的區域。首先找到與接穗高度、橫截面積生長相關性狀緊密連鎖的SSR標記，從而確定QTL區域在遺傳圖譜上的位置。然后通過SSR標記在‘金冠’蘋果參考基因組物理圖譜的位置，確定候選基因在物理圖譜上的位置，通過GDR網站（http://www.rosaceae.org/species/malus/malus x domestica/genome v1.0），在‘金冠’蘋果基因組相應區域，根據所有基因的功能注釋信息，預測與植株生長性狀相關的候選基因。

2 結果

2.1 生長性狀的遺傳分析

對親本G.41和新疆野蘋果的F1代188株個體進行表型鑒定，發現F1代發生較大變異，其表型變異均呈連續變異分布符合正態分布的特點（圖1、表1）。接穗高度（SH）偏度為-0.367，峰度為-0.478；接穗橫截面積（TCA）偏度為-0.217，峰度為-0.795。進一步證明了該生長性狀是由微效多基因控制的數量性狀。相關性分析發現，接穗高度與接穗橫截面積之間存在極顯著的正相關關系，R=0.606（P＜0.01）。

2.2 遺傳圖譜的構建及生長相關性狀QTL初步定位

利用親本及6個F1代個體進行多態性引物的篩選，361對SSR引物中108對引物具有多態性，占總引物的29.9%。將108對多態性引物全部用于F1群體多態性分析，其中95對SSR引物能夠成功應用于群體遺傳圖譜構建，最終構建了一張包含15個連鎖群，95個SSR標記的遺傳圖譜（附圖1）。遺傳圖譜總長度為897.2 cM，平均圖距為9.4 cM。5號連鎖群中SSR標記分布較多，有18個。

表1 作圖群體生長性狀正態分布檢測Table 1 Test of normal distribution for growth trait in mapping population

圖1 生長性狀在作圖群體中的頻率分布圖Fig. 1 The frequency distribution of growth traits in mapping population

利用MapQTL5.0對植株生長相關性狀的QTL進行分析，共檢測到 4個與植株生長性狀相關的QTL（圖2、表2）。其中，與接穗高度性狀相關的QTL位點SH-1，定位在SSR標記CH04g09和 C12371之間，LOD=7.03，解釋的表型變異率為 25.5%（表2）；與接穗高度性狀相關的 QTL位點SH-2，定位在SSR標記C21057和CH03a09之間，LOD=7.57，解釋的表型變異率為19.3%（表2）。

圖2 遺傳連鎖圖譜構建與蘋果生長相關性狀QTL定位Fig. 2 QTL mapping for apple growth traits on genetic linkage map

與接穗橫截面積性狀相關的QTL位點TCA-1，定位在SSR標記CH04g09和C12371之間，LOD=17.55，解釋的表型變異率為 55.1%（表2）。與接穗橫截面積性狀相關的QTL位點TCA-2，定位在SSR標記C21057和 CH03a09之間，LOD=24.32，解釋的表型變異率為51.9%（表2）。

2.3 SSR引物開發及精細定位

根據生長性狀QTL初步定位區間的基因組序列，設計了新的SSR引物24對，其中在親本間表現出多態的有10對（表3）。

利用該10對在親本間表現出多態性的SSR引物，對5號連鎖群重新分析。構建了包含21個SSR標記標記、總長為86.0 cM的遺傳圖譜，其平均遺傳距離為7.52 cM。

其中，在遺傳距離為3.68 cM范圍內，與蘋果生長性狀連鎖最緊密的SSR標記為L05018、L05024、C13449、Hi09b04。SSR標記在蘋果5號連鎖群的位置、LOD值、表型變異解釋等信息見表4，QTL位點在染色體上的分布見圖3。

2.4 候選基因的預測

根據QTL顯著性區間內的SSR標記所在參考基因組中的位置，利用蘋果基因組計劃提供的基因預測、注釋結果，對生長基因定位區域進行了候選基因的預測。發現在與接穗高度、接穗橫截面積性狀緊密連鎖的兩個標記L05024和Hi09b04之間，其物理距離為4.048—4.591 Mb范圍內，共包含95個基因，在染色體上的分布見圖4。

這些注釋基因的功能主要有：鋅指蛋白、DNA綁定、氧化還原酶、雙鏈 RNA結合蛋白等。其中篩選出16個已知功能注釋的基因（表5），其中1個基因可能與植株生長性狀相關。基因MDP0000323212來源于序列MDC019125.95，該基因序列長度855 bp，該基因家族基因是與植物休眠和生長素抑制蛋白相關基因，包括3部分編碼序列。

表2 蘋果生長性狀的QTL位點分布Table 2 QTLs of agronomic traits using Map QTL 5.0

表3 蘋果5號染色體開發的SSR標記Table 3 SSR markers developed on LG5 in apple

3 討論

蘋果砧木育種是實現蘋果高產的重要方式之一，在前人對蘋果砧木研究中發現，砧木對地上部接穗的生長具有重要的影響[4]。接穗高度、接穗橫截面積已經被廣泛看做砧木誘導接穗矮化的特征指標[15-16]。本研究以G.41×新疆野蘋果雜交F1代為試材，在其上嫁接‘富士冠軍’接穗，通過對接穗高度和接穗橫截面積的調查，也發現蘋果砧木對接穗生長具有重要影響。研究結果表明，生長性狀是由蘋果砧木誘導的微效多基因控制的數量性狀。

表4 生長相關性狀的QTL位點Table 4 QTLs of growth traits

表5 生長候選基因的功能注釋Table 5 Functional annotation of candidate genes for growth

圖3 QTL位點在染色體上的分布Fig. 3 Distribution of QTLs in the chromosome 5 of G.41

砧木誘導接穗矮化是一個極其復雜的性狀，不僅受到砧木與接穗基因型的的影響，而且受到環境以及嫁接技術等因素的影響[15]。本研究通過選取長勢一致的‘富士冠軍’嫁接到雜交F1代植株上，并在相同環境條件下進行管理，以減小誤差。相對于農作物和蔬菜作物，蘋果砧木等多年生果樹的遺傳圖譜通常以雜交F1代、雜交F2代和BC群體為研究對象，本研究以F1代為研究對象，通過對188株F1個體嫁接‘富士冠軍’接穗進行表型鑒定，作圖群體相對較大，定位結果更加準確[9]。

圖4 候選基因在5號染色體上的分布Fig. 4 Distribution of predicted genes on chromosome 5

近年來，以 DNA分子標記技術為基礎，構建相應的遺傳圖譜，對目標性狀進行QTL定位，成為果樹遺傳育種研究的熱點。利用DNA分子標記進行分子標記輔助選擇，可以提高育種效率，加速育種進程。本研究利用廣泛分布于生物基因組中的遺傳多態性高、重復穩定性好的共顯性 SSR標記[26-28]，通過全基因組QTL定位分析，在母本‘G.41’的5號連鎖群上定位到與接穗高度和接穗橫截面積性狀相關的QTL位點。在實驗室前期研究和其他相關研究[13-17]基礎上，本研究結合初步定位情況，在目標區域開發了一批SSR引物。相對于LIEBHARD等[29]在整個蘋果基因組范圍內對遺傳圖譜進行加密，本試驗對 5號染色體目標QTL區域進行SSR標記加密，提高了遺傳圖譜的分辨率，有利于候選基因預測，其效率更高，成本更低。

本研究將與接穗高度相關 QTL定位到了蘋果 5號連鎖群上，其峰值標記為 L05024，LOD=8.46，解釋的表型變異率為19.2%。KENIS等[30]同樣定位到與植株高度相關的 QTL位點，其解釋的表型變異率為3.9%—7.9%，相對于 KENIS等[30]的研究，本研究解釋的表型變異率更高，結果更準確。PILCHER等[13]和 FOSTER等[15]利用矮化砧木‘M.9’和喬化砧木‘Robusta 5’的后代群體為試材，定位到了位于‘M.9’的5號連鎖群和11號連鎖群以及‘R.5’的6號連鎖群的一系列與一年生接穗高度相關QTL位點，且該位點成簇分布，并將該系列位點命名為蘋果砧木誘導矮化主效Dw1、Dw2位點。本研究中在母本‘G.41’的5號連鎖群上同樣找到了與一年生接穗高度和接穗橫截面積相關 QTL位點，且該位點在染色體成簇分布，與PILCHER等[8]結果一致。另外，接穗高度與接穗橫截面積性狀相關性極顯著，可能存在一因多效現象。HARRISON等[16]研究認為根皮率與蘋果砧木誘導矮化相關，并與接穗直徑呈顯著負相關，相對于 HARRISON等[16]的研究，本研究進一步分析預測了與植株生長相關的基因，為今后基因克隆及分子輔助育種打下了一定基礎。

4 結論

本研究以矮化蘋果砧木‘G.41’和喬化蘋果砧木新疆野蘋果（Malus sieversii）為親本構建的F1代分離群體為試材，基于SSR標記技術，構建了蘋果5號染色體的遺傳連鎖圖，最近的兩側翼SSR標記為L05024和Hi09b04，該區段物理距離為543 kb，并將蘋果砧木誘導接穗生長候選基因確定到16個基因范圍內，根據蘋果基因組數據庫對基因的分析及其注釋信息，進一步確定了MDP0000323212可能參與植株生長的調控。

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