無毒性產氣莢膜梭菌ε毒素突變體的表達及免疫保護力評價

杜吉革，薛麒，朱真，李啟紅，印春生，姚文生，康凱，陳小云

（中國獸醫藥品監察所牛羊病實驗室，北京 100081）

0 引言

【研究意義】 產氣莢膜梭菌是一種重要的人畜共患病原，嚴重危害著畜牧業的健康發展[1-4]。該菌的主要致病因子是其分泌的能引起人和動物發病的外毒素[5]。其中，ETX是該菌所有外毒素中毒力最強的毒素[6]，可引起動物的壞死性腸炎或者腸毒血癥[7-9]，導致感染動物在很短的時間內死亡[10-11]，從而使抗生素治療失去意義，疫苗注射成為了防治該病的主要手段。然而，傳統ETX的類毒素疫苗抗原成分復雜，有效抗原量較低，且脫毒過程中存在一定的安全隱患。因此，實現ETX的減毒乃至無毒，對于開發ETX基因工程亞單位疫苗具有重要意義。【前人研究進展】ETX是由B型和D型產氣莢膜梭菌產生[12]，由296個氨基酸構成。ETX以毒素前體的形式分泌于菌體外[13]，隨后毒素前體在宿主的胰蛋白酶、糜蛋白酶或梭菌自身蛋白酶的作用下去掉N端11—13個以及C端22—29個氨基酸，從而成為活化的成熟毒素[14-15]。該毒素屬于成孔毒素家族，在結構上主要分為I、II和III 3個區域，分別在毒素與細胞受體結合過程、與細胞受體結合穩定性的維持以及細胞膜穿孔的形成過程中發揮著重要作用[16]。由于該毒素有 2條肽鏈同時跨過 I，II和III 3個區域[17]，導致僅使用毒素的一個域作為疫苗候選抗原的策略（如 α、β毒素的 C末端[18-19]）很難應用于該毒素的防控。已有的研究證實，組氨酸殘基是影響 ETX蛋白活性的關鍵性氨基酸，而第106位的組氨酸突變為脯氨酸的重組ETX基本是無毒的[20-22]。此外，ETX中I區域內的一組芳香族氨基酸（Tyr29、Tyr30、Tyr36、Tyr196以及Phe199）構成了毒素的受體結合區域[23]。其中，第199位的苯丙氨酸突變為谷氨酸后，突變體的細胞毒性明顯下降（約為野生型重組毒素的1/2 527）。進一步的研究發現，以上兩種單位點突變體的蛋白質三級結構并未發生明顯改變，說明以上兩處氨基酸位點發生突變后，蛋白活性的改變與結構并沒有直接的關系，從而保持了良好的抗原性[24]。【本研究切入點】前人的研究主要是在野生型 ETX基礎上進行單點突變，表達的重組蛋白可溶性較低，不利于后續的大量生產和純化。已有的研究發現，將目的基因按照大腸桿菌偏好的密碼子進行優化后可明顯提高目的蛋白的可溶表達[25-27]。此外，單個氨基酸突變的ETX在未來基因工程疫苗大規模生產中存在一定的生物安全隱患。【擬解決的關鍵問題】本研究根據現行D型產氣莢膜梭菌制苗用菌株（C60-2株）ETX的編碼序列，按大腸桿菌偏愛的密碼子進行優化設計和人工合成，并將其第106和第199位氨基酸位點同時進行突變，經原核系統表達、純化和鑒定，并對重組蛋白的毒力和免疫保護性進行研究，為 D型產氣莢膜梭菌的防制提供一定的數據支持。

1 材料與方法

試驗于2017年4—10月在中國獸醫藥品監察所牛羊病實驗室完成。

1.1 試驗材料

D型產氣莢膜梭菌C60-2株、D型產氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素、D型產氣莢膜梭菌抗血清以及pET-30a(+)表達載體為中國獸醫藥品監察所牛羊病實驗室保存；1.5—2.0 kg普通級健康日本大耳兔和16—18g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受態細胞Top10和BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；Montanide ISA 201佐劑購自法國賽彼科（seppic）公司；Ni-IDA親和層析介質試劑盒、蛋白 Marker、Western blot Marker、 蛋 白 溶 解 液 （ 50 mmol·L-1Tris-HCl, 10% Glycerol, 150 mmol·L-1NaCl, pH 8.0），均購自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶（KFX-401S）購自東洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker購自Takara公司。T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自Promaga公司；限制性內切酶NdeⅠ和HindIII購自NEB公司；抗His標簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司；明膠緩沖溶液，LB培養基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優化

以前期擴增獲得的 D型產氣莢膜梭菌 C60-2株 ETX編碼基因為模版，按大腸桿菌偏愛的密碼子進行優化設計，并將第106位組氨酸以及第199位的苯丙氨酸分別突變為脯氨酸和谷氨酸。此外，在目的基因3′端添加6*His標簽蛋白編碼序列，最后由南京金斯瑞生物科技有限公司合成目的基因GETXm2。

1.3 ETX突變體原核表達載體的構建

以GETXm2基因為模板，采用引物對GETXm2-F/GETXm2-R進行PCR擴增。其中上游引物GETXm2-F序列為：5′-CGCCATATG AAAGAAATCTC -3′，其5′端引入限制性內切酶NdeⅠ位點（下劃線部分）及保護性堿基；下游引物 GETXm2-R序列為：5′-CCGAAGCTT TTAGTGGTGATG，其 5′端引入限制性內切酶HindIII位點（下劃線部分）及保護性堿基。PCR體系為 50 μL。PCR反應條件為：94℃預變性4 min；98℃變性10 s，56℃退火30 s，68℃延伸70 s，共33個循環；最后68℃延伸7 min。回收擴增獲得的DNA條帶，采用NdeⅠ/HindIII 雙酶切后與經過相同處理的 pET30a（+）載體連接。將連接好的質粒轉化Top10感受態細胞，挑取單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定，鑒定結果為陽性的質粒送中美泰和公司測序，將測序正確的質粒命名為pET30a-GETXm2。

1.4 重組蛋白的表達與鑒定

將 pET30a-GETXm2質粒轉化 BL21（DE3）感受態細胞，分別在15℃和37℃條件下用IPTG誘導表達，收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況及其可溶性，將表達的重組蛋白稱為rETXm2。采用Western blot方法，以抗His標簽蛋白抗體為一抗，對重組蛋白做進一步的鑒定。

1.5 重組蛋白的純化與鑒定

按照 Ni-IDA親和層析介質試劑盒的使用說明書對菌體裂解上清中呈可溶性表達的目的蛋白進行純化，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，-80℃保存備用。將純化后的目的蛋白（0.5μg）經SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜上，以D型產氣莢膜梭菌抗血清為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗進行孵育，按照底物顯色試劑盒說明書進行顯色，檢測純化的重組蛋白與D型產氣莢膜梭菌抗血清的反應情況。

1.6 重組蛋白的毒性分析

1.6.1 細胞毒性試驗 將MDCK細胞接種96孔細胞培養板，置37℃、含5% CO2的培養箱中培養至形成細胞單層后，棄細胞生長液。將rETXm2用細胞維持液稀釋至 100 μg·mL-1以及 10μg·mL-1，每個稀釋度各接種3孔細胞，每孔100μL，置37℃、含5% CO2的培養箱中培養24 h，觀察并記錄細胞的病變情況。同時將肉肝胃酶消化湯和洗脫液用細胞維持液稀釋100倍后，分別孵育細胞，作為陰性對照組，將 D型產氣莢膜梭菌C60-2株天然毒素做2000倍稀釋后作為陽性對照。

1.6.2 小鼠的毒力測定 已有的研究發現，產氣莢膜梭菌ETX毒素首先以前體毒素形式分泌，當被蛋白酶，如胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶等，切除N端以及C端相應的氨基酸后，毒素被活化，從而發揮相應的生物活性[21-23]。活化的ETX對小鼠的半數致死量可達50 ng·kg-1[28]。本文按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）[26]規定的方法，用終濃度為1%的胰酶對純化的rETXm2在37℃條件下活化1 h。將16—18 g的ICR小鼠隨機分為9組，每組5只。分別用活化前和活化后的rETXm2進行尾靜脈注射，注射劑量分為 0.001 mg（0.0625 mg·kg-1）、0.01 mg（0.625 mg·kg-1）、0.1 mg（6.25 mg·kg-1）3 個注射劑量。同時設置胰酶消化液（終濃度為1%）以及蛋白溶解液兩個陰性對照和1個小鼠MLD的D型產氣莢膜梭菌天然毒素陽性對照。樣品均用明膠緩沖液進行稀釋，注射的液體總體積為200μL，觀察2d，記錄小鼠的存活狀態。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 免疫程序 合適濃度的純化 rETXm2與Montanide ISA 201佐劑以1:1（v/v）的比例配制成rETXm2終濃度為 50 μg·mL-1的疫苗，另取滅菌 PBS 與Montanide ISA 201佐劑以1:1（v/v）的比例制備對照疫苗，置4℃保存備用。選用體重1.5—2.0 kg健康家兔，測定免疫前每只家兔血清對D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價。取8只對D型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價為0的家兔，其中4只分別頸部皮下注射疫苗，2.0mL/只，免疫14 d后，以相同劑量、相同途徑進行第二次免疫。另外4只以相同劑量、相同途徑和相同方法免疫對照疫苗作為對照組。

1.7.2 血清中和抗體效價測定 分別在一免后 14 d以及二免后21 d，對試驗組及對照組所有兔經耳緣靜脈采血，分離血清備用。按照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）3部中規定的方法測定血清中和效價[29]。

1.7.3 攻毒試驗 二免后21 d，對免疫組及對照組所有家兔經耳緣靜脈各注射 1 MLD的天然毒素進行攻毒，觀察5 d，記錄家兔的死亡情況。根據免疫組及對照組家兔的死亡情況，判定試驗疫苗的免疫保護效力。

2 結果

2.1 ETX毒素突變體原核表達載體的構建

采用引物GETXm2-F/GETXm2-R進行PCR擴增，擴增片段經酶切后克隆至pET-30a（+）載體上。獲得的重組質粒經雙酶切后電泳觀察，結果如圖1所示。酶切后出現大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約920 bp的目的基因片段，與預期相符。測序結果表明，插入的外源基因序列正確，將此重組質粒命名為pET30a-GETXm2。

圖1 原核表達重組質粒pET30a-GETXm2的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pET30a-GETXm2

2.2 ETX毒素突變體的原核表達鑒定

將pET30a-GETXm2轉化至BL21（DE3）感受態細胞并誘導表達。SDS-PAGE和Western blot檢測結果顯示，表達的重組蛋白rETXm2分子量約為39 kD，大小與預期相符。rETXm2在 BL21（DE3）菌體中以可溶性和包涵體兩種形式表達（圖2）。圖2-a為rETXm2的SDS-PAGE鑒定結果。如圖所示，rETXm2在15℃和37℃條件均有較高水平的表達，且rETXm2在15℃條件下可溶性表達比例大于后者。綜合考慮 rETXm2的表達量、可溶性及誘導時間等，可以確定rETXm2的最適誘導表達條件為37℃，誘導表達4 h，收獲細胞裂解上清。灰度掃描結果顯示，該誘導條件下的可溶表達蛋白比例可達 30%。圖2-b為重組蛋白的Western blot鑒定結果，如圖所示，重組蛋白能與抗His標簽抗體發生反應，證明目的蛋白含有His標簽，與預期相符。

圖2 rETXm2的原核表達與鑒定Fig. 2 Prokaryotic expression and identification of rETXm2

2.3 rETXm2的純化與鑒定

如圖3所示，按照Ni-IDA親和層析介質試劑盒說明書對 rETXm2進行純化，收集純度較高的洗脫液（50 mmol·L-1Imidazole 以及 300 mmol·L-1Imidazole的洗脫液）進行透析，最終獲得的蛋白濃度為 1.2 mg·mL-1，純度可達90%以上。將純化后的rETXm2經SDS-PAGE后轉印到 PVDF膜上進行 Western blot檢測。結果顯示，rETXm2能夠與D型產氣莢膜梭菌抗血清反應（圖4）。

2.4 rETXm2的毒力測定

2.4.1 對MDCK細胞的毒力測定 MDCK細胞加入各組分后繼續培養24 h，顯微鏡下觀察。結果如圖5所示，2 000倍稀釋的天然D型產氣莢膜梭菌毒素接種細胞組出現了明顯的細胞病變（圖5-a）；接種濃度為100 μg·mL-1和 10 μg·mL-1的 rETXm2蛋白試驗組（圖5-b）、接種肉肝胃酶消化湯和洗脫液的陰性對照組及空白對照組細胞均生長良好，未出現細胞病變（圖5-c）。

2.4.2 對小鼠的毒力測定 結果如表1所示，rETXm2注射組、蛋白溶解液以及胰酶消化液兩個陰性對照組小鼠，在注射后24 h均存活，未見任何異常，而注射1個小鼠MLD的D型產氣莢膜梭菌毒素的小鼠，在注射后24 h內全部死亡，說明rETXm2減毒成功。

圖3 rETXm2的純化Fig. 3 Purification of rETXm2

圖4 rETXm2與 D型產氣莢膜梭菌抗血清反應的 Western blot鑒定Fig. 4 Interaction of rETXm2 with antitoxin serum ofClostridium perfringens type D

圖5 rETXm2對MDCK細胞的影響Fig. 5 The influence of rETXm2 to MDCK cell

表1 注射rETXm2小鼠的存活情況Table 1 Survival of mice challenged with rETXm2

2.5 rETXm2的免疫原性分析

2.5.1 抗 rETXm2兔血清的毒素中和抗體效價測定如表2所示，經血清中和法測定，以rETXm2免疫家兔后，每毫升的一免抗血清可中和 450—750個小鼠MLD的D型產氣莢膜梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和2 500—4 000個小鼠MLD的D型產氣莢膜梭菌毒素，而佐劑對照組的兔血清對D型產氣莢膜梭菌毒素無中和作用。以上試驗結果表明，rETXm2的免疫效力遠高于現行《中華人民共和國獸藥典》規定的標準（30個小鼠MLD/mL），是優良的制苗用候選抗原。

2.5.2 攻毒保護性試驗 在二免后 21 d，對所有rETXm2免疫組和佐劑免疫對照組的家兔，經耳緣靜脈注射1個家兔MLD劑量的天然毒素進行攻毒，結果如圖1所示，佐劑免疫對照組家兔在攻毒后5 d內全部死亡，rETXm2免疫組家兔全部健活，未見任何不良反應。

表2 rETXm2免疫兔血清的中和效價和免疫保護Table 2 Neutralizing titers of rabbit antiserum against rETXm2 and immuno protection of rETXm

3 討論

作為一種潛在的生物武器，ETX的毒力僅次于肉毒毒素和破傷風毒素，可引起家禽和家畜特別是反芻動物強烈的腸毒血癥，給畜牧業造成嚴重的經濟損失[1-4]。因此，實現ETX的減毒乃至無毒的同時保留其免疫原性，進而制備適當的疫苗等生物制劑，具有經濟性和生物安全性兩方面的重要意義。李箐[24]等通過原核系統獲得的可溶性重組 ETX具有較強的毒力，導致野生型重組ETX在該毒素亞單位疫苗的制備過程中同樣存在毒素外泄或滅活不徹底等生物安全隱患。

在無毒重組 ETX亞單位疫苗的研究中，作為經典的無細胞毒性突變體，rETXH106P的安全性和免疫原性已經得到大量的驗證[20-22]。李箐[24]等對ETX的第106位組氨酸、第111位色氨酸及第199位苯丙氨酸的突變體進行了研究。結果表明，rETXH106P的安全性最高，其次為 rETXF199E。其獲得的野生型重組ETX（rETX）對MDCK細胞的半數細胞致死濃度（CT50）為 37.73± 12.55ng·mL-1，而濃度為 100 μg·mL-1的 rETXH106P對 MDCK 細胞仍無毒力，rETXF199E的細胞毒力則為 rETX的1/2527。本文同時突變以上兩個氨基酸位點，獲得rETXm2，其細胞毒性檢測結果進一步支持了該結論。然而，已有的研究發現，rETXH106P的可溶性表達量非常低（小于5%）[24,30]，不利于大量生產及純化。而本研究中的rETXm2可溶性表達量較高，這可能是由于本研究按照大腸桿菌偏愛的密碼子，對 rETXm2進行了優化。根據已有的文獻報道，50 ng·mL-1的天然ETX即可引起小鼠死亡，而本研究發現，以 6.25 mg·kg-1劑量的 rETXm2尾靜脈注射ICR小鼠后，小鼠全部存活（5/5），證明rETXm2具有良好的安全性。

自然環境中對動物致病的梭菌種類較多，且常混合感染，因而梭菌病的預防多采用聯苗，以達到一針多防的目的。目前我國該類商品化疫苗均為天然毒素經甲醛脫毒后制備的類毒素疫苗，生產過程中需采用肉肝胃酶消化湯等天然成分較多的培養基，易導致產毒不穩定，難以保證批間一致性。此外，其抗原成分復雜，有效抗原含量較低，導致各菌株的類毒素免疫劑量均較高，制備聯苗后免疫劑量過大，容易引起動物的應激反應。如曾經廣泛使用的“羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯滅活疫苗”，因免疫劑量為每只羊5 mL，現已難以被養殖戶所接受。根據《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）三部的規定，在此類疫苗檢驗中，對D型產氣莢膜梭菌毒素的兔血清中和效價達到 3個小鼠MLD的D型產氣莢膜梭菌毒素（30 MLD·mL-1）即可判為合格。雖然該標準為疫苗的最低標準，但從中國獸醫藥品監察所歷年的獸用生物制品監督檢驗結果來看，目前我國該類疫苗的免疫效力不容樂觀，疫苗抽檢不合格的情況時有發生（http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201504/t20150402_4472055. htm）。彭小兵等對自 2006—2015年間的此類疫苗檢驗結果的統計發現，以血清中和法檢驗后效力不符合規定的產品共有33批，其中β毒素組分效力不符合規定的比例最高，約為 72.7%[31]。然而，鑒于此類聯苗免疫劑量的限制，無法再大程度增加β類毒素的比例。為此，產氣莢膜梭菌毒素亞單位疫苗的研制顯得極為重要。在一定的范圍內，可以最大幅度地增大免疫原性較差的毒素抗原（如β類毒素），從而提高聯苗的總體免疫保護作用。而本研究中制備的rETXm2一免兔血清每毫升可中和450 MLD以上，二免兔血清每毫升可中和2 500 MLD以上，效果明顯優于目前的商品化疫苗。

4 結論

對D型產氣莢膜梭菌C60-2株的ETX編碼基因進行突變和密碼子優化，通過基因合成獲得了含有H106P和 F199E兩個氨基酸突變的 ETX編碼基因GETXm2，經原核系統表達并純化，獲得可溶性比例達 30%的重組蛋白 rETXm2。該蛋白在本研究的檢測范圍內同時失去了對MDCK細胞和小鼠的毒力，但仍保留了良好的免疫保護性，從而為我國現行 D型產氣莢膜梭菌毒素疫苗升級換代提供了的理想候選疫苗抗原。

[1]鄭曉麗, 竇賢明, 胡道俊, 肖勇, 趙翠榮, 倪學勤. 產氣莢膜梭菌對養牛業的危害及其防制. 中國畜牧獸醫, 2010, 37(8):211-214.ZHENG X L, DOU X M, HU D J, XIAO Y, ZHAO C R, NI X Q. The threat , prevention and control ofClostridium perfringensin cattle industry.China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2010,37(8):211-214. (in Chinese)

[2]釧有科, 肖嘯, 濮永華, 龔興建. 努比亞山羊產氣莢膜梭菌病的診治. 中國獸醫雜志, 2014, 50(12): 42-43.CHUAN Y K, XIAO X, PU Y H, GONG X J. Diagnosis and treatment ofClostridium perfringensinfection in Nubian goats.Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2014, 50(12):42-43.(in Chinese)

[3]VAN I F, DE B J, PASMANS F, HUYGHEBAER G,HAESEBROUCK K, DUCATELLE R.Clostridium perfringensin poultry: an emerging threat for animal and public health.Avian Pathology, 2004, 33(6):537-549.

[4]鄭曉麗, 宋振銀, 倪學勤. 產氣莢膜梭菌對家禽業的危害及其預防.中國家禽, 2008, 30(24): 69-71.ZHENG X L, SONG Z Y, NI X Q. Hazards and prevention ofClostridium perfringensto poultry industry.China Poultry, 2008,30(24):69-71.(in Chinese)

[5]REVITT-MILLS S A, ROOD J I, ADAMS V.Clostridium perfringensextracellular toxins and enzymes: 20 and counting.Microbiology Australia,2015, 36(3): 114-117.

[6]LI J H, Adams V, Bannam T L, Miyamoto K, Garcia J P, Uzal F A, Rood J L, McClanea B A. Toxin plasmids ofclostridium perfringens. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2013,77(2): 208-233.

[7]MCCLAIN M S, COVER T L. Functional analysis of neutralizing antibodies againstClostridium perfringensepsilon-toxin.Infection and Immunity,2007, 75(4):1785-1793.

[8]LEWIS M, WEAVER C D, MCCLAIN M S. Identification of small molecule inhibitors ofClostridium perfringensepsilon-toxin cytotoxicity using a cell-based high-throughput screen.Toxins, 2010,2(7):1825-1847.

[9]DORCA-AREVALO J, SOLER-JOVER A, GIBERT M, POPOFF M R, MARTIN-SATUE M, BLASI J. Binding of epsilon-toxin fromClostridium perfringensin the nervous system.Veterinary Microbiology,2008, 131(1-2):14-25.

[10]POPOFF M R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin.FEBS Journal, 2011, 278(23):4602-4615.

[11]FINNIE J W. Neurological disorders produced byClostridium perfringenstype D epsilon toxin.Anaerobe, 2004, 10(2): 145-150.

[12]SAYEED S, LI J H, MCCLANE B A. Virulence plasmid diversity inClostridium perfringenstype D isolates.Infection and Immunity, 2007,75(5):2391-2398.

[13]HUNTER S E, CLARKE I N, KELLY D C, TITBALL R W. Cloning and nucleotide sequencing of theClostridium perfringensepsilontoxin gene and its expression inEscherichia coli.Infection and Immunity, 1992, 60(1):102-110.

[14]MINAMI J, KATAYAMA S, MATSUSHITA O, MATSUSHITA C,OKABE A. Lambda-toxin ofClostridium perfringensactivates the precursor of epsilon-toxin by releasing its N- and C-terminal peptides.Microbiology and Immunology, 1997, 41(7):527-535.

[15]FREEDMAN J C, MCCLANE B A, UZAL F A. New insights intoClostridium perfringensepsilon toxin activation and action on the brain during enterotoxemia.Anaerobe, 2016, 41: 27-31.

[16]ALVES G G, RA M D á, CHáVEZOLóRTEGUI C D, LOBATO F C F.Clostridium perfringensepsilon toxin: The third most potent bacterial toxin known.Anaerobe, 2014, 30:102-107.

[17]COLE A R, GIBERT M, POPOFF M, MOSS D S, TITBALL R W,BASAK A K.Clostridium perfringensepsilon-toxin shows structural similarity to the pore-forming toxin aerolysin.Nature Structural and Molecular Biology, 2004, 11(8):797-798.

[18]NAGAHAMA M, ODA M, KOBAYASHI K, OCHI S, TAKAGISHI T,SHIBUTANI M, SAKURAI J. A recombinant carboxy-terminal domain of alpha-toxin protects mice againstClostridium perfringens.Microbiology and Immunology, 2013, 57(5):340-345.

[19]DAS S, MAJUMDER S, KINGSTON J J, BATRA H V. Generation and characterization of recombinant bivalent fusion protein r-Cpib for immunotherapy againstClostridium perfringensbeta and iota toxemia.Molecular Immunology,2016, 70:140-148.

[20]ALIMOLAEI M, GOLCHIN M, DANESHVAR H. Oral immunization of mice againstClostridium perfringens, epsilon toxin with aLactobacillus casei, vector vaccine expressing epsilon toxoid.Infection,Genetics and Evolution, 2016, 40:282-287.

[21]LI Q, XIN W, GAO S, KANG L, WANG J. A low-toxic site-directed mutant ofClostridium perfringenserfringens low-toxic site-directed mutant of Closenterotoxemia.Human Vaccines and Immunotherapeutics,2013, 9(11):2386-2392.

[22]DORCA-ARéVALO J, PAUILLAC S, DLAZ-HIDALGO L,MARTíN-SATUé M, POPOFF M R, BLASI J. Correlation betweenin vitrocytotoxicity andin vivolethal activity in mice of epsilon toxin mutants fromClostridium perfringens.PLoS One, 2014, 9(7):e102417.

[23]IVIE S E, MCCLAIN M S. Identification of amino acids important for binding ofClostridium perfringensepsilon toxin to host cells and to HAVCR1.Biochemistry, 2012, 51: 7588-7595.

[24]李箐.產氣莢膜梭菌α、ε毒素突變體構建及應用[D]. 安徽: 安徽醫科大學, 2013.LI Q. Construction of mutants ofClostridium perfringensAlpha,epsilon toxin and it’s application[D]. Anhui: Anhui Medical University,2013. (in Chinese)

[25]羅維佳, 鄧晨, 李衍常, 高媛, 徐平. 串聯雜種泛素結合結構域蛋白(ThUBD)在大腸桿菌中的可溶性高效表達. 軍事醫學, 2016,40(10):795-800.LUO W J, DONG C, LI Y C, GAO Y, XU P. Soluble expression of tandem hybrid ubiquitin-binding domains（ThUBD）In prokaryotic cytoplasm ofEscherichiacoliBL21(DE3).Military Medical Sciences,2016, 40(10):795-800. (in Chinese)

[26]于蕊, 王雙, 余云舟, 俞煒源, 孫志偉. B型肉毒毒素保護性抗原He在大腸桿菌中的可溶性高表達. 生物技術通訊, 2008, 19(3):365-367.YU R, WANG S, YU Y Z, YU W Y, SUN Z W. High-level and soluble expression of Botulinum Neurotoxin serotype B protective antigen HC domain inEscherichiacoli. Letter in Biotechnology,2008,19(3):365-367. (in Chinese)

[27]黃保英, 王文玲, 王秀平, 蔣濤, 譚文杰, 阮力. 甲型流感病毒核蛋白在大腸桿菌中的可溶性高效表達與純化. 病毒學報,2011(1):50-57.HUANG B Y, WANG W L, WANG X P, JIANG T, TAN W J,RUAN L. Efficient soluble expression and purification of influenza A nucleoprotein inEscherichiacoli. Chinese Journal of Virology,2011(1): 50-57. (in Chinese)

[28]BOKORI-BROWN M, SAVVA C G, FERNANDES DA COSTA S P,NAYLOR C E, BASAK A K, TITBALL R W. Molecular basis of toxicity ofClostridium perfringensepsilon toxin.FEBS Journal, 2011,278(23):4589-2011.

[29]中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典2015年版三部. 北京：中國農業出版社，2016:45-46.Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. Veterinary Pharmacopoeia of the People’s Republic of China volume Ⅲ2015 edition. Beijing: China Agricultural Press, 2016:45-46. (in Chinese)

[30]OYSTON P C F, PAYNE D W, HAVARD H L, WILLIANMSON D,TITBALL R W. Production of a non-toxic site-directed mutant ofClostridium perfringensepsilon-toxin which induces protective immunity in mice.Microbiology, 1998, 144 (2):333-341.

[31]彭小兵, 田冬青, 彭國瑞, 李旭妮, 王蒙, 蔣玉文. 產氣莢膜梭菌β毒素的表達及其抗血清的制備. 畜牧與獸醫, 2015, 47(10):93-96.PENG X B, TIAN D Q, PENG G R, LI X N, WANG M, JIANG Y W.Expression ofClostridium perfringensβ toxin and preparation of its antiserum.Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2015, 47(10):93-96. (in Chinese)