代乳粉對早期斷奶沂蒙黑山羊羔小腸發育、菌群多樣性及葡萄糖轉運載體基因表達的影響

李永洙，金太花，韓照清，夏春峰，晁洪雨，張乃鋒，王世琴，刁其玉

（1中國農業科學院飼料研究所，農業部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；2臨沂大學農林科學學院，山東臨沂276000）

0 引言

【研究意義】在現代養羊業生產中，為充分發揮母羊繁殖性能，對羔羊采取早期斷奶，并利用代乳粉替代母乳。羔羊從母乳到代乳粉、固體飼料的替換以及無反芻到有反芻階段的轉變，都會對早期斷奶羔羊生長發育產生不良影響。其中，斷奶應激影響羔羊腸道菌群的平衡，造成腸道消化不良、生長發育緩慢、消化系統功能紊亂[1]等。葡萄糖轉運載體影響小腸黏膜上皮細胞對單糖的吸收轉運，進而影響羔羊腸道發育[2-3]。因此，探討早期斷奶羔羊飼喂代乳粉，其腸道菌群定植以及葡萄糖在小腸中吸收轉運規律，對于促進早期斷奶羔羊生長發育具有重要的意義。【前人研究進展】已有研究表明，日糧中養分的均衡度、可消化吸收的難易程度、微生物數量及產生的毒素等均可導致腸道發育和功能發生程序化改變[4]。胃腸道微生物區系是影響胃腸道正常消化功能的主要因素之一，有助于分解飼料中各種纖維、淀粉、蛋白等營養物質，其微生態平衡與飼糧、品種、健康狀況、生活環境及環境中共生微生物間的群體效應等有關[5-6]，而羔羊瘤胃初期尚未發育健全，因此其養分消化吸收與小腸生理功能的發揮直接有關。哺乳動物機體通過 SGLT-1激活蛋白激酶C（PKC）依賴性通路調節GLUT-2對葡萄糖的轉運，決定小腸轉運葡萄糖的效率，進而影響小腸發育程度[7-8]。此外，有研究報道，營養條件的改變會使得SGLT-1和GLUT-2的基因表達量降低[9]，還可能影響動物基因的表達[10]和蛋白的合成，包括酶的分泌、受體的合成等[11]，而基因表達以及蛋白合成的改變也可能會直接或間接的影響動物的生長速度。【本研究切入點】但是目前關于飼喂代乳粉條件下，沂蒙黑山羊雙胎羔羊的小腸發育與菌群定植規律、小腸葡萄糖轉運載體基因表達量的研究尚未見報道。沂蒙黑山羊屬于肉皮絨兼用，具有適應性強、抗病力強、耐粗飼等優點的山東省優良地方品種之一，其繁殖性能為全年發情，可達到1年1胎或2年3胎，每胎產羔 1—2只等特點[12]。本試驗采用沂蒙黑山羊雙胎羔羊作為研究對象，針對早期斷奶沂蒙黑山羊羔羊在飼喂代乳粉條件下腸道發育及菌群定植規律、小腸葡萄糖轉運載體基因表達量的影響進行研究。【擬解決的關鍵問題】旨在揭示飼喂代乳粉對早期斷奶沂蒙黑山羊羔羊小腸發育與菌群定植規律以及葡萄糖轉運載體基因表達量相關性問題，為羔羊飼喂代乳粉及開食料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2015年10月至2016年4月在山東省臨沂市沂南縣龍吟莊園黑山羊養殖專業合作社進行。

1.2 試驗設計

選用雙胎沂蒙黑山羊羔羊 36只（初生重 1.84±0.86kg，均為公羊），分成2組，每組6個重復，每個重復3只。對照組（Ⅰ組）隨母哺乳至75日齡，試驗組（Ⅱ組）于8日齡開始逐步斷奶，并在第10日齡完全斷奶后飼喂代乳粉，所有羔羊第 15日齡起補飼開食料，試驗期為75 d。分別于第10、15、25、45和75天稱重，并各取3只進行屠宰、稱十二指腸、空腸、回腸重量以及收集其內容物、黏膜組織樣品。屠宰前停食、停水12 h。

1.3 試驗飼糧

中國農業科學院飼料研究所提供本試驗所需的代乳粉（主要參照發明專利ZL201210365927.6[13]）和開食料。其原料組成與營養水平見表1、2。

表1 代乳粉的組成及營養水平 (干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of milk replacer(DM basis)

1.4 測定日糧的方法

1.4.1 飼料樣品 代乳粉和開食料各采樣點收集 1次，各混合攪拌均勻后冷凍保存，檢測前在烘箱中48h制備風干樣品，采用常規分析法[14]測定代乳粉和開食料中相關的養分含量。另外，各采樣點的代乳粉稀釋液、母乳和開食料收集1次，混合后過濾冷凍保存，最終10、15、25、45和75 d的各自混合物再度混合成食糜中微生物的待測樣。

1.4.2 母乳養分及活性物質 在10、45、75 d收集早晨哺乳前母乳2 mL，并在4℃、6 000 r/min轉速下離心20 min，移除上層乳脂和沉淀物，取上清液放置-80℃冰箱中凍存待測。母乳中類胰島素因子（IGF-1）、表皮細胞生長因子（EGF）、超氧化物歧化酶（SOD），均使用雙抗體夾心生物素-親和素酶聯免疫吸附（ABC-ELISA）試劑盒，試劑盒均為美國R&D公司提供。利用酶標分析儀（DNM-9602G）測定吸光度，其波長為450 nm，操作嚴格按照試劑盒說明書執行。

表2 開食料原料組成及營養水平(干物質基礎)Table 2 Composition and nutritional level of starters (DM basis)

表3 沂蒙黑山羊母乳營養及活性物質水平Table 3 The level of nutrition and active substance in the milk of Yimeng black goat

1.5 飼養管理

參照王海超等[15]方法哺喂羔羊，羔羊均于15 d開始訓練采食相同的開食料，自由采食和飲水。表4為兩組羔羊從15 d開始在不同日齡階段日均開食料干物質采食量。

表4 沂蒙黑山羊羔羊不同日齡階段日均干物質采食量Table 4 Average daily DM intake of Yimeng black goat lambs at different days of age（g）

1.6 屠宰及樣品采集

屠宰時采用頸靜脈放血，屠宰后，打開腹腔，立即結扎賁門瓣、直腸遠段，將羔羊胃腸道取出，小心剝離并在腸段連接處進行結扎、剪斷。在無菌操作臺下，分別收集十二指腸、空腸和回腸的內容物，將3只羔羊各自不同部位腸內容物均勻混合，分裝到2 mL離心管，-20℃保存備用，用于分析菌群多樣性。另外，去除腸系膜與小腸外部脂肪，分離小腸各腸段，用生理鹽水漂洗后，分別對十二指腸近端（5 cm處）、空腸近端1/4處及回腸末端（靠近盲腸20 cm處）剪開，并用載玻片刮取黏膜組織樣，及時裝入已消毒的離心管，速用液氮冷凍并轉入-80℃冰箱儲存，用于分析相關基因表達量。

1.7 小腸菌群多樣性分析

1.7.1 提取細菌總DNA 利用QIA amp? DNA Stool Mini Kit試劑盒提取細菌總DNA。采用核酸濃度測定儀（ND-2000）測定總DNA濃度，-20 ℃保存待測。

1.7.2 分析基因組總 DNA 16S rDNA V3區擴增片段參照李永洙等[16]方法，PCR 反應體系（50 μL）：10×緩沖液 5 μL（含 15 mmol·L-1MgCl2），d NTP（10 mmol·μL-1）4 μL，引物（27f-GC、1495r, 10μmol·μL-1）1 μL、模板 DNA1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5U·μL-1）0.5 μL，ddH2O補足50 μL。用于擴增細菌16S rDNA V3區基因的通用引物序列為，上游引物：AD27f-GC（5'-AGAGTTTGA TCCTGG-3'）和下游引物：1495 r（5'-CTACGGCTACCTTGTA -3'），由上海生工生物技術有限公司合成。

1.7.3 分析基因組總DNA 16S rDNA V3區擴增片段以及割膠回收、提純和基因載體的連接、檢測 參照李永洙等[16]方法，使用Bio-Rad Dcode進行DGGE凝膠電泳，并對相應的微衛星引物（27f和1495r）進行二次PCR擴增。此后，用無菌手術刀將凝膠電泳割膠回收，對其回收產物進行提純，構建克隆文庫，并用PCR和電泳確定克隆片段的正確性。PCR產物經過處理后用310型DNA測序儀測序。所得上述結果在Gen Bank數據庫中進行檢索對比，確定細菌種類和名稱，并進行同源性分析。

1.8 小腸葡萄糖轉運載體基因相對表達量的分析

1.8.1 小腸內容物中總RNA提取 取十二指腸、空場和回腸內容物100 mg，使用Trizol（in vitro gen）試劑盒提取總RNA，核酸濃度測定儀（ND-2000）測定RNA濃度及純度。

1.8.2 總RNA質量及反轉錄效果檢測 通過1%的瓊脂糖凝膠電泳評估總RNA的質量見圖1。總RNA的28 S和18 S兩條帶清晰，無DNA污染條帶及明顯降解條帶，表明提取總RNA純度較高，質量可靠。

圖1 總RNA凝膠電泳圖Fig. 1 The electrophoresis gram of total RNA

1.8.3 引物檢測 以不同組織總RNA的逆轉錄產物為模板，采用常規 PCR法對所設計的 2對引物（SGLT-1和GLUT-2）進行擴增，經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖2。

圖2 SGLT-1和GLUT-2 mRNA實時熒光定量PCR電泳圖Fig. 2 The electrophoresis gram of SGLT1 and GLUT-2 mRNA by real-time fluorescence quantitative PCR

1.8.4 DNA消化和反轉錄 分別取3 μg總RNA，對其利用DNA酶（Fermentas）去除痕量DNA后，之后反轉錄獲得各樣品RNA的c DNA產物。并保存于-20℃備用。

1.8.5 目的基因引物設計和 RT-PCR反應條件建立使用Primer 5軟件設計引物，依托上海生工生物技術有限公司合成，引物序列及參數見表5。以?-actin管家基因作為內標，采用Real-Time PCR法對SGLT-1、GLUT-2mRNA表達量進行分析。以最小Ct值和最高熒光值為標準。

1.8.6 PCR產物克隆、序列測定及RT-PCR分析 分析擴增產物，并對切膠回收純化之后，將純化產物連接于載體中（pGEM-T Easy）。把連接產物轉接到E.coliDH5a 感受態細胞上，采用菌落PCR法鑒定陽性克隆和測序，將上述測序結果依據 Gen-Bank登錄的SGLT-1、GLUT-2和?-actin 基因序列進行比對分析。

1.8.7 實時熒光定量PCR 參照TAVERNIERS等[17]方法，提取陽性克隆質粒，其濃度用紫外分光光度儀（UV-6000PC）測定，使用已優化條件的 PCR進行RT-PCR，縱坐標為Ct值，橫坐標為稀釋倍數的對數，繪制相對定量標準曲線。以?-actin為內標，對SGLT-1、GLUT-2相對表達量定量分析。

1.9 數據統計分析

1.9.1 使用分析軟件 Bio Numerics 3.0（Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium）來分析 PCRDGGE 指紋圖譜進行條帶計數，利用 Dice法計算相似性指數Cs，采用UPGM-A（un weighted pair group mean average）進行聚類分析。

1.9.2 采用 2△△CT法[18]計算相關基因相對表達量，數據以平均值±標準差（Mean ±SD）表示，n=3，用SAS 8.0統計軟件進行單因子方差分析（One-way ANOVA），以Duncan氏方法進行多重比較。

表5 Real-Time PCR中使用的各種引物Table 5 Primers for Real-Time PCR

2 結果

2.1 飼喂代乳粉對沂蒙黑山羊羔羊日增重以及腸道發育的影響

從表6中可見，Ⅱ組平均日增重第10、15天時小于Ⅰ組，到 25 d時大于Ⅰ組，但差異均不顯著（P＞0.05），而45 d時顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），第75 天時其差異極顯著（P＜0.01）。另外，10—25d間Ⅱ組十二指腸重量小于Ⅰ組，25d后大于Ⅰ組，但差異均不顯著（P＞0.05）；Ⅱ組空腸、回腸重量25 d時大于Ⅰ組，但差異均不顯著（P＞0.05），而45 d時其差異顯著（P＜0.05），第75 天時回腸差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 飼喂代乳粉對沂蒙黑山羊羔羊小腸微生物菌群多樣性的影響

從圖3中可見，盡管哺喂母乳和代乳粉，但由于統一使用開食料，所以不可避免的產生共性條帶；在小腸同一部位，不同日齡平均條帶數差異顯著（P＜0.05），其中空腸、回腸平均條帶數顯著高于十二指腸（P＜0.05）。兩組空腸內容物混合物中細菌種類分別 14、14、9、11、12（共 60）和 11、10、12、15、13（共61）條；而十二指腸中細菌種類分別15、14、15、8、12（共 64）和 12、13、11、11、13（共 60）條；回腸中細菌種類分別13、10、14、11、9（共57）和8、12、13、14、13（共60）條。結果表明十二指腸在45、75 d，空腸在15 d，回腸在10 d時兩組間菌群變化較為明顯（P＜0.05）。

采用Shannon-Wiener指數和Simpson指數方法對小腸部位菌群多樣性進行分析，其結果見表7。Ⅰ、Ⅱ組菌群多樣性變化較為相似，10、25 d時多樣性指數Ⅰ組大于Ⅱ組，而45、75 d時Ⅱ大于Ⅰ組；Ⅰ組回腸平均多樣性指數大于Ⅱ組，而十二指腸平均多樣性指數小于Ⅱ組，且差異不顯著（P＞0.05）；對于小腸各腸段菌落多樣性指數，從高到低依次排序，分別為回腸、空腸和十二指腸，且差異不顯著（P＞0.05）。

表6 代乳粉對沂蒙黑山羊羔羊日增重及腸道發育的影響Table 6 Effect of milk replacer on daily gain and development of intestine of Yimeng black goat lambs (g)

圖3 不同腸段微生物細菌16S rDNA基因V3區共性、特異性PCR-DGGE指紋圖譜Fig. 3 Common character and specificity PCR-DGGE DNA fingerprint of the V3 region of 16S rDNA gene in the microbial bacteria of different intestinal segments

2.3 飼喂代乳粉對沂蒙黑山羊小腸內容物中菌落組成的影響

從圖4中可見，Ⅰ組十二指腸菌群相似性指數在15 d時達到高峰，且極顯著高于45、75 d（P＜0.01），Ⅱ組10 d時顯著高于25、45 d（P＜0.05），而45 d后呈上升趨勢；Ⅰ、Ⅱ組空腸分別在25、15 d時達到高峰，且均顯著高于 75 d（P＜0.05）；Ⅰ組回腸在15、75 d 相似性指數顯著低于 10、25、45 d（P＜0.05），而Ⅱ組15 d后呈上升趨勢，且75 d時差異極顯著高于15 d（P＜0.01）。結果表明Ⅰ組空腸、回腸相似性指數在25 d后呈下降趨勢，且回腸在75 d時顯著下降（P＜0.05）；Ⅱ組15 d后空腸相似性指數下降，而回腸上升，且差異極顯著（P＜0.01）。

Ⅰ、Ⅱ組 16S rDNA 基因 V3 區PCR-DGGE圖譜的PCA分析見圖5。結果顯示，Ⅰ、Ⅱ組10、15 d時各腸段菌群組成與食糜（F）相似，而25 d時Ⅰ、Ⅱ組的空腸與回腸菌群組成有分開趨勢，45 d空腸與回腸菌群組成分開明顯。

表7 不同腸段腸道菌群的Shannon-Wiener指數和Simpson指數變化Table 7 Shannon-Wiener and Simpson index changes of intestinal flora in the different intestinal segments

圖4 腸道不同部位主要菌群相似性系數關系Fig. 4 Similarity coefficient relation of the main flora in the different parts of the intestine

2.4 飼喂代乳粉對沂蒙黑山羊羔羊小腸腸道內容物菌落物種多樣性的影響

圖3中箭頭所指的指紋圖譜中分別割膠回收測序結果見表8。兩組各腸段部位菌群定植受到食糜中的溶淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus strain2條帶）、普雷沃氏菌（Prevotella species3條帶）影響較大。Ⅰ組十二指腸的草酸桿菌（Oxalobacteraceae bacterium5條帶）、發酵乳桿菌（Lactobacillus vaginalispartial8條帶）在45 d時消失，而75 d時可檢測；與Ⅰ組相比，Ⅱ組草酸桿菌（Oxalobacteraceae bacterium5條帶）提前在25 d時消失，45 d時可檢測發酵乳桿菌（Lactobacillus vaginalis partial8條帶）。Ⅰ組空腸的約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii11條帶）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium strain14條帶）、不可培養細菌（Uncultured Acetanaero bacterium sp15條帶）在25 d后消失，而Ⅱ組25 d后可檢測約氏乳桿菌，45、75 d時均可檢測到不可培養細菌（Uncultured Acetanaero bacterium sp15條帶）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium strain14條帶）。Ⅰ組回腸的不可培養細菌（Uncultured Acetanaero bacterium sp15條帶）在10 d消失，而Ⅱ組在15d之后均可檢測；Ⅰ組回腸的發酵乳桿菌（Lactobacillus vaginalis partial8條帶）、食淀粉乳桿菌（Lactobacillus_amy-lovorus20條帶）在25 d后消失，而Ⅱ組25 d后均可檢測。本試驗測序結果與Gen Bank數據庫微生物同源性比較分析來看，其同源性大部分超過98%甚至100%。然而，對于具有92、90、92、90%同源性的3、5、12、17條帶的普雷沃氏菌（Prevotella species）、草酸桿菌（Oxalobacteraceae bacterium）、瘤胃球菌（Ruminococcaceae）和氨基酸球菌（AcidaMinoCoccaceae）可推測為新種。

圖5 不同腸段微生物細菌16S rDNA基因V3區PCR-DGGE指紋圖譜的PCA分析Fig. 5 PCA analysis of the V3 region PCR-DGGE finger print of 16S rRNA gene of microbial bacterial in the different intestinal segments

2.5 沂蒙黑山羊羔羊小腸組織中葡萄糖轉運載體（SGLT-1、GLUT-2）基因mRNA表達量分析

圖6中可見，Ⅰ組各腸段中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達量25 d時最低，而后逐漸升高，但差異不顯著（P＞0.05）；Ⅱ組除空腸黏膜中GLUT-2mRNA表達量以外（P＜0.05），各腸段中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達量10 d時最低（P＜0.01），而25 d后其表達量顯著高與10d（P＜0.05）；Ⅱ組各腸段中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達量在 25 d后均高于Ⅰ組；SGLT-1和GLUT-2基因表達量呈現腸段部位間差異。其中，SGLT-1mRNA表達量在空腸最為明顯，其次為回腸，十二指腸最低，而GLUT-2mRNA表達量在十二指腸最為明顯，其次為空腸和回腸。

3 討論

3.1 代乳粉對沂蒙黑山羊羔羊日增重以及腸道發育的影響

刁其玉等[19]認為，代乳粉可以作為早期斷奶羔羊母乳的代替品，但其效果受到諸多方面影響。譬如，代乳粉營養素的組成、飼喂方式、斷奶日齡、羔羊健康狀態、設施環境等。已有研究表明，代乳粉組在試驗初期與母乳組比較體重差異不明顯，而后期代乳粉組平均體重及日增重均大于母乳組，羔羊體增重和平均日增重相對于母羊哺乳的羔羊分別高于 26.4%和18.6%。另外，代乳粉組羔羊的十二指腸、空腸、回腸鮮重分別比對照組高14.85%、10.61%、75.28%。其中，回腸發育差異較大[20-21]。此外，張慶麗等[9]報道，早期能量與蛋白質缺乏對 28日齡斷奶羔羊胃腸道器官發育有顯著影響。本研究中，25 d時飼喂代乳粉羔羊的日增重速度和腸道發育較慢，顯著低于母乳組，而45 d時羔羊平均日增重、空腸和回腸重量顯著高于母乳組，且75 d時差異極顯著，與前者試驗結果相一致。這可能是與母乳和代乳粉營養物質的組成直接相關，本研究檢測母乳中營養物質以及活性物質，其結果顯示25 d后母乳中活性物質指標顯著下降，并且蛋白能量比與代乳粉組比較逐漸降低，這些蛋白能量營養素的短缺影響瘦肉組織沉積和蛋白質合成周轉，導致日增重偏低[22]，而代乳粉中養分含量相對穩定，雖然在試驗初期應激較大，但經過20 d左右適應過程促進羔羊的腸道發育乃至生長發育。

表8 PCR-DGGE共性條帶和特異性條帶的基因片段序列的比對結果Table 8 The comparison results of gene fragment sequences of PCR-DGGE common and specific bands analysis

圖6 SGLT-1mRNA在沂蒙黑山羊羔羊小腸中的差異性表達Fig. 6 The differential expression of SGLT-1 mRNA in small intestine of Yimeng black goat lambs

圖7 GLUT-2 mRNA在沂蒙黑山羊羔羊小腸中的差異性表達Fig. 7 The differential expression of GLUT-2 mRNA in small intestine of Yimeng black goat lambs

3.2 飼喂代乳粉對沂蒙黑山羊羔羊小腸微生物菌群多樣性的影響

已有研究報道[19-20]，飼糧組成、日齡以及環境條件均影響腸道菌群結構。其中，日齡因素對腸道早期菌群定植影響較大，而到成熟期腸道菌群定植趨于相對平衡，此后腸道菌群多樣性主要受到飼料組成和飼養環境條件的影響[23]。李小鵬等[24]認為，反芻動物胃腸道內微生物區系不是一出生就存在的，而是出生后隨著與母體和環境的接觸，經過消化道環境的適應和選擇，經定植、存活和繁殖逐步建立起來的。當家畜發生應激（環境條件）時，可引起宿主腸道菌落結構的變化，導致消化道菌群紊亂，微生態平衡破壞[25]。相似性指數的高低間接地說明共性菌群以外的菌群情況[26]。本研究結果表明，Ⅰ組回腸在25 d后相似性指數呈下降趨勢，而Ⅱ組回腸在15 d后逐漸上升。筆者認為，瘤胃功能尚未健全之際，作為微生物較為豐富的回腸，在代乳粉飼喂25 d后共性菌群比率逐漸增加，促進其菌群平衡，反映羔羊腸道適應環境應激狀態。對于反芻動物而言，按不同的生理階段分為非反芻階段（1—20日齡），過渡階段（21—56日齡），反芻階段（57日齡后），而在反芻功能逐漸完善過程中胃腸道生理機能和菌落會發生較大變化[27-28]。本試驗結果表明，空腸和回腸在 25 d后菌群變化較為明顯，而十二指腸在45、75 d時菌群變化較大。有研究已證實，除了瘤胃具有強大的降解纖維物質的能力外，反芻動物小腸（包括空腸和回腸）對飼糧纖維類物質亦有很強的補償消化能力，說明反芻動物后消化道消化能力的建立和完善與后腸道定植的細菌數量和種類直接相關[29-30]。本研究結果也反映代乳粉飼喂對后腸道菌群定植有一定的影響作用，Ⅱ組十二指腸發酵乳桿菌，空腸約氏乳桿菌、巨大芽孢桿菌，回腸發酵乳桿菌、食淀粉乳桿菌等有益菌與Ⅰ組相比提前定植，本試驗結果與UYENO等[31]分析荷斯坦母牛從出生到 12周的腸道菌群結構變化結果相吻合。

3.3 沂蒙黑山羊羔羊小腸組織黏膜葡萄糖轉運載體基因的表達

鈉依賴性葡萄糖轉運載體-1（SGLT-1）和促葡萄糖轉運載體-2（GLUT-2）是小腸中葡萄糖的吸收所需要的特殊葡萄糖轉運載體[33]。家畜腸道葡萄糖轉運載體基因 mRNA表達量的變化反映了動物胃腸道中營養物質吸收的狀態，哺乳動物從出生至斷奶階段，SGLT-1基因在腸道中的表達較強，對己糖的攝取能力強；斷奶后，SGLT-1基因的表達量明顯減少，對己糖的吸收也減少[34]。本試驗結果也顯示，Ⅱ組 8 d開始斷奶后10 d時SGLT-1和GLUT-2mRNA表達量最低，而25 d后Ⅱ組表達量均高于Ⅰ組，此結果與Ⅱ組沂蒙黑山羔羊斷奶過渡階段羔羊機體組織從依賴母乳中葡萄糖轉換為依靠腸道生酮作用而提供能量的生理變化適應過程直接相關。另外，25 d后Ⅰ組母乳中蛋白能量比的逐漸下降，會導致羔羊生長發育嚴重受阻，且機體組織細胞發育、增殖的調控轉錄表達都受到抑制[35]，以及影響胃腸道葡萄糖轉運載體相關基因表達[36]。羔羊由于處在特殊的生理階段，對碳水化合物的消化吸收與單胃動物相似。本研究結果顯示，飼喂代乳粉25 d時有益菌定植，有助于腸道分解消化能力，導致胃腸道內葡萄糖濃度有所升高。當腸腔中葡萄糖的含量較高時，反芻動物可以通過增加葡萄糖轉運載體的數量從而調整它們的吸收能力以提高小腸中葡萄糖的吸收效率[37-38]，進而腸道的吸收功能得到增強，有利于斷奶后羔羊胃腸道功能的正常發揮。

總之，本研究結果表明，各腸段SGLT-1和GLUT-2mRNA表達量在25 d后Ⅱ組均高于Ⅰ組，此時空腸和回腸的菌群變化最大，并且有益菌定植比Ⅰ組提前，而日增重與空腸和回腸發育均在45d時Ⅱ組均顯著高于Ⅰ組。這一結果說明除日糧（包括母乳）營養素原因之外，可能還有代乳粉飼喂25d時有益菌提前定植，提高腸道分解消化能力，造成胃腸道內葡萄糖濃度有所升高，影響空腸和回腸中SGLT-1和GLUT-2mRNA表達量，而葡萄糖轉運載體基因表達量的變化直接影響腸道組織發育乃至機體生長發育，至于其分子機制需要進一步研究。

4 結論

飼喂代乳粉第 25天時促進沂蒙黑山羊早期斷奶羔羊空腸、回腸有益菌提前定植，并通過調控葡萄糖轉運載體基因表達而引起葡萄糖吸收轉運的改變，進而影響羔羊后期腸道組織及機體的生長發育。

[1]THEISS A L, FRUCHTMAN，LUND P K. Growth factors in inflammatory bowel disease: The actions and interactions of growth hormone and insulin-like growth factor-I.Inflammatory Bowel Diseases2004, 10(6): 871-880.

[2]張航, 劉強, 王聰, 張延利, 裴彩霞, 王永新, 郭剛, 霍文婕, 張拴林. 2-甲基丁酸對犢牛小腸酶活及葡萄糖轉運載體基因表達的影響. 中國農業科學, 2016, 49(5): 979-987.ZHANG H, LIU Q, WANG C, ZHANG Y L, PEI C X, WANG Y X,GUO G, HUO W J, ZHANG S L. Effects of 2-methylbutyrate on digestive enzymes activities and gene expression of glucose cotransporter of small intestine in calves.Scientia Agricultura Sinica,2016, 49(5): 979-987. (in Chinese)

[3]VELAYUDHAN B T, DANIELS K M, HORRELL D P, HILL S R,MCGILLIARD M L, CORL B A, JIANG H, AKERS R M.Developmental histology, segmental expression, and nutritional regulation of somatotropic axis genes in small intestine of pre-weaned dairy heifers.Journal of Dairy Science, 2008, 91(9): 3343-3352.

[4]SUN Z H, HE Z X, ZHANG Q L, TAN Z L, HAN X F, TANG S X,ZHOU C S, WANG M, ZHANG E P. Effects of protein and /or energy restriction for six weeks on antioxidation capacity of Plasma and gastrointestinal epithelial tissues of weaned kids.Livestock Science, 2012, 149(3): 232-241.

[5]MACKIE R I, WHITE B A. Recent advances in rumen microbial ecology and metabolism: Potential impact on nutrient output.Journal of Dairy Science, 1990,73(10): 2971-2995.

[6]盧玉飛, 周凌云, 趙圣國, 卜登攀, 孫鵬, 趙國琦. 近 10年瘤胃微生物分離培養研究進展. 中國微生態學雜志, 2012, 24(9): 856-862.LU Y F, ZHOU L Y, ZHAO S G, BU D P, SUN P, ZHAO G Q.Progress on isolation and culture of rumen microorganisms in recent ten years.Chinese Journal of Microecology, 2012, 24(9): 856-862. (in Chinese)

[7]KELLETT G L. The facilitated component of intestinal glucose absorption.Journal of Physiology, 2001, 531(3): 585-595.

[8]梁艷, 劉強, 王聰, 張延利, 裴彩霞, 王永新, 郭剛, 霍文婕, 張拴林, 石彩葉, 劉建新. 異丁酸對犢牛瘤胃及小腸黏膜基因表達的影響. 動物營養學報, 2015, 27(8): 2483-2492.LIANG Y, LIU Q, WANG C, ZHANG Y L, PEI C X, WANG Y X,GUO G, HUO W J, ZHANG S L, SHI C Y, LIU J X. Effects of isobutyrate on gene expressions of ruminal and small intestinal mucosa of calves.Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(8):2483-2492. (in Chinese)

[9]LIU J, LIU Z, GAO L, CHEN L, ZHANG H. Nutrient-intake-leveldependent regulation of intestinal development in newborn intrauterine growth-restricted piglets via glucagon-like Peptide-2.Animal, 2016, 10(10): 1645-1654.

[10]BRANDSTETTER A M, PFAFFL M W, HOCQUETTE J F,GERRARD D E, PICARD B, GEAY Y, SAUERWEIN H. Effects of muscle type, castration, age, and compensatory growth rate on androgen receptor mRNA expression in bovine skeletal muscle.Journal of Animal Science, 2000, 78: 629-637.

[11]HAN H C, AUSTIN K J, NATHANIELSZ P W, FORD S P,NIJLAND M J, HANSEN T R. Maternal nutrient restriction alters gene expression in the ovine fetal heart.The Journal of Physiology,2004, 558(1): 111-121.

[12]王建民, 曹洪防, 王桂芝, 謝之景, 劉珊珊. 山東及國內優良羊品種介紹（下）. 農業知識: 科學養殖, 2011: 6-12.WANG J M, CAO H F, WANG G Z, XIE Z J, LIU S S. Introduction of fine sheep breeds in Shandong and in domestic (next) .Agricultural Knowledge: Scientific Breeding, 2011: 6-12. (in Chinese)

[13]屠焰, 刁其玉, 岳喜新. 一種0-3月齡羔羊的代乳品及其制備方法:中國, 201210365927.6[P]. 2013.TU Y, DIAO Q Y, YUE X X. The Milk replacer for 0-3 month of lambs and its preparation method: China, 201210365927.6 [P]. 2013.(in Chinese)

[14]張麗英. 飼料分析及飼料質量檢測技術. 北京：中國農業大學出版社 2007.ZHANG L Y.Feed Analysis and Feed Quality Inspection Technology.Beijing: China Agricultural University Press, 2007. (in Chinese)

[15]王海超, 張乃鋒, 柴建民, 王波, 刁其玉. 培育方式對雙胞胎湖羊羔羊肝基因表達的影響. 畜牧獸醫學報, 2016, 47(4): 733-744.WANG H C, ZHANG N F, CHAI J M, WANG B, DIAO Q Y. Effect of different rearing systems on hepatic gene expression of early weaned Hu Twin Lambs.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2016, 47(4): 733-744. (in Chinese)

[16]李永洙, 陳常秀, Yong-quan Cui. 熱應激對蛋雞腸道菌群結構、堿性磷酸酶活性及氨基酸轉運載體mRNA表達豐度的影響. 中國農業科學, 2013, 46(20): 4378-4387.LI Y Z，CHEN C X，CUI Y Q. Effect of heat stress on the intestinal flora structure and alkaline phosphatase activities and mRNA expression of amino acid transporters of layer.Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(20): 4378-4387. (in Chinese)

[17]TAVERNIERS I, BOCKSTAELE E V, LOOSE M D. Cloned plasmid DNA fragments as calibrators for controlling GMOs: different real-time duplex quantitative PCR methods.Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2004, 378 (5): 1198-1207.

[18]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[19]刁其玉, 屠焰, 于雪初, 張林. 羔羊專用代乳粉的營養特性. 中國飼料, 2003, (7) : 18-19.DIAO Q Y, TU Y, YU X C, ZHANG L. The nutritional properties of the milk replacer special for lambs.China Feed, 2003, (7): 18-19. (in Chinese)

[20]江喜春, 夏倫志, 張乃鋒, 謝俊龍, 陳麗園, 柴建民, 刁其玉. 代乳粉能量水平對早期斷奶湖羊羔羊生長性能和物質代謝的影響. 中國畜牧雜志, 2015, 51(7): 50-53.JIANG X C, XIA L Z, ZHANG N F, XIE J L, CHEN L Y, CHAI J M,DIAO Q Y. Effect of energy level of milk replacer on growth performance and nutrient utilization in Hu Lambs.Chinese Journal of Animal Science, 2015, 51(7): 50-53. (in Chinese)

[21]岳喜新, 刁其玉, 馬春暉, 鄧凱東, 屠焰, 姜成鋼, 杜紅芳. 早期斷奶羔羊代乳粉飼喂水平對營養物質消化代謝及血清生化指標的影響. 中國農業科學, 2011, 44(21): 4464-4473.YUE X X, DIAO Q Y, MA C H, DENG K D, TU Y, JIANG C G, DU H F. Effects of feeding levels of a milk replacer on digestion and metabolism of nutrients, and serum biochemical indexes in lambs.Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(21): 4464-4473. (in Chinese)

[22]CHIBA L I, LEWIS A J, PEO JR E R. Amino acid and energy interrelationships in pigs weighing 20 to 50 kilograms: I. Rate and efficiency of weight gain.Journal of Animal Science, 1991, 69:696-707.

[23]劉艷豐, 侯廣田, 唐淑珍, 王文奇. 代乳品對羔羊早期斷奶生產性能的影響. 飼料研究, 2011, (11): 63-64.LIU Y F, HOU G T, TANG S Z, WANG W Q. The effect of the milk replacer on the performance of early weaned lambs.Feed Research,2011, (11): 63-64. (in Chinese)

[24]李小鵬, 焦金真, 顏瓊嫻, 譚支良. 山羊羔羊回腸細菌群落定植與消化功能的發育性變化. 動物營養學報, 2016, 28(3): 731-738.LI X P, JIAO J Z, YAN Q X, TAN Z L. Developmental changes in bacterial colonization and digestive function in ileum of lambs.Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(3): 731-738. (in Chinese)

[25]BONNET S, GERAERT P A, LESSIRE M, CARRE B,GUILLAUMIN S. Effect of high ambient temperature on feed digestibility in broilers. Poultry Science, 1997, 96:857-863.

[26]HUME M E, KUBENA L F, EDRINGTON T S, DONSKEY C J,MOORE R W, RICKE S C, NISBET D J. Poultry digestive microflora biodiversity as indicated by denaturing gradient Gel electrophoresis.Poultry Science, 2003, 82: 1100-1107.

[27]KRAUSE D O, NAGARAJA T G, WRIGHT A D G, CALLAWAY T R. Board-invited review: Rumen microbiology: Leading the way in microbial ecology.Journal of Animal Science, 2013, 91(1): 331-341.

[28]REY M, ENJALBERT F, MONTEILS V. Establishment of ruminal enzyme activities and fermentation capacity in dairy calves from birth through weaning.Journal of Dairy Science, 2012, 95(3): 1500-1512.

[29]TAN Z L, LU D X, HU M, NIU W Y, HAN C Y, REN X P, NA R,LIN S L. Effect of dietary structural to nonstructural carbohydrate ratio on rumen degradability and digestibility of fiber fractions of wheat straw in sheep .Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2002, 15(11): 1594-1598.

[30]TAN Z L, LU D X, HU M, NIU W Y, HAN C Y, REN X P, NA R,LIN S L. Effects of dietary nitrogen sources on fiber digestion and ruminal fluid characteristics in sheep fed wheat straw.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2001, 14(10): 1374-1382.

[31]UYENO Y, SEKIGUCHI Y, KAMAGATA Y. rRNA-based analysis to monitor succession of faecal bacterial communities in Holstein calves.Letter in Applied Microbiology, 2010, 51(5): 570-577.

[32]郭慧玲, 邵玉宇, 孟和畢力格, 張和平. 腸道菌群與疾病關系的研究進展. 微生物學通報, 2015, 42(2): 400-410.GUO H L, SHAO Y Y, MENGHEBILIGE, ZHANG H P. Research on the relation between gastrointestinal microbiota and disease.Microbiology China, 2015, 42(2): 400-410. (in Chinese)

[33]ZHAO F Q, OKINE E K, CHEESEMAN C I, SHIRAZI-BEECHEY S P, KENNELLY J J. Glucose transporter gene expression in lactating bovine gastrointestinal tract.Journal of Animal Science, 1998, 76(11):2921-2929.

[34]HAYASHI H, YONEZAWA T, KANETANI T, TERADA F,KATOH K, OBARA Y. Expression of mRNA for sodium-glucose transporter 1 and fatty acid translocase in the ruminant gastrointestinal tract before and after weaning.Animal Science Journal, 2005, 76(4):339-344.

[35]張慶麗.早期能量與蛋白限制飼養對1月齡斷奶羔羊胃腸道發育的影響[D]. 楊凌：西北農林科技大學, 2010.ZHANG Q L. Effects of early energy and protein restricted feeding on gastrointestinal development of weaned lambs at age of 1 month[D].Yangling: Northwest A&F University, 2010. (in Chinese)

[36]吳建, 李小鵬, 賀志雄, 焦金真, 譚支良. 妊娠后期營養限制對母羊胃腸道葡萄糖轉運載體相關基因表達的影響. 動物營養學報,2017, 29(2): 645-651.WU J, LI X P, HE Z X, JIAO J Z, TAN Z L. Effects of nutritional restriction during late gestation on gene expressions of glucose transporters in gastrointestinal tract of ewes Chinese Journal of Animal Nutrition, 2017, 29(2):645-651. (in Chinese)

[37]DYER J, VAYRO S, KING T P, SHIRAZI- BEECHEY S P. Glucose sensing in the intestinal epithelium.European Journal of Biochemistry,2003, 270: 3377- 3388.

[38]LOHRENZ A K, DUSKE K, SCHONHUSEN U, LOSAND B,SEYFERT H M, METGES C C, HAMMON H M. Glucose transporters and enzymes related to glucose synthesis in small intestinal mucosa of mid-lactation dairy cows fed 2 levels of starch.Journal of Dairy Science,2011, 94(9): 4546-4555.