家蠶脫膠蠶絲的蛋白組成成分

張艷，董照明，席星航，張曉璐，葉林，郭凱雨，夏慶友，趙萍

（西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室/重慶市蠶絲纖維新材料工程技術研究中心/西南大學生物技術學院，重慶 400715）

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）是一種重要的經濟昆蟲，最重要的經濟價值在于可以生產一種天然的高分子纖維材料——蠶絲。絲素蛋白構成了蠶絲的核心纖維，而絲膠包裹在絲素的外圍，具有保護和膠著絲素的作用。除了絲素與絲膠外，筆者課題組在最近的研究中從蠶絲中鑒定到了酶、蛋白酶抑制劑和未知功能蛋白等上百種蛋白質[1-2]。另外，蠶絲中還含有糖、脂、氨基酸、有機酸和烷烴等小分子物質，它們主要存在于絲膠層中[3]。蠶絲應用于紡織工業需要經過一系列的加工過程，絲素在這個過程中基本不變，而絕大部分絲膠則在煮繭、繅絲和精煉的過程中被脫去并排放掉，而其他絲蛋白的變化情況至今未被闡明。因此，對蠶絲加工過程中蛋白質組分的變化進行研究，不僅有利于深入理解蠶絲的蛋白質組分與特性，而且有利于探索更加先進的蠶絲加工工藝。【前人研究進展】蠶絲的主要組分是絲素蛋白（fibroin）和絲膠（sericin）蛋白[4]。絲素是一種纖維蛋白，是絲的中心成分，約占絲重的70%—80%。絲素蛋白含有3種成分：390 kD的重鏈蛋白（H-chain）、25 kD的輕鏈蛋白（L-chain)和27或30 kD的fibrohexamerin/P25蛋白（fhx）[5-7]。這 3種絲素蛋白在后部絲腺細胞內按照一定的比例（H-chain:L-chain:fhx=6:6:1）形成絲素蛋白基本單位，然后被分泌到絲腺腔[5]。絲膠是一種膠狀的球蛋白，存在于絲素的外圍，包被著絲素，對絲素起著保護和膠黏作用。目前已發現3種絲膠蛋白，包括絲膠1、絲膠2和絲膠3[8-11]。絲膠1和絲膠3的主要作用是黏附絲素纖維以形成繭；絲膠2不存在于蠶繭中，卻在繭網和小蠶的蠶絲中被檢測到，它具有更好的黏性，可能的作用是將蠶繭或幼蟲黏附于周圍物體，從而防止蠶體掉落，幫助蛻皮和結繭[9-10]。為了深入了解蠶絲的蛋白組分，DONG等[1]收集了家蠶在不同發育時期所分泌的7種蠶絲，利用蛋白質組學的方法從各種蠶絲中共鑒定到500種蛋白質，通過GO分類和非標記定量分析，發現蠶絲中的主要蛋白質包括絲素、絲膠、蛋白酶抑制劑、酶、未知功能蛋白；ZHANG等[2]對家蠶蠶繭中處于不同分層的繭絲進行蛋白質組學鑒定，也鑒定到了同樣類型的絲蛋白，并且發現蠶繭外層絲比內層絲擁有更多的絲膠1和蛋白酶抑制劑；DONG等[12]通過調查各種絲蛋白在絲腺腔內的動態變化過程，發現絲素、絲膠、蛋白酶抑制劑、seroin以及未知功能蛋白都是在食桑期的絲腺內不斷積累，構成了蠶絲的主要成分，而酶類等其他絲蛋白并不是絲蛋白的主要成分；GUO等[13]發現繭絲中的蛋白酶抑制劑不僅對真菌蛋白酶表現出高效的抑制活性，還能夠抑制白僵菌孢子的萌發。蠶絲中還存在另外一類抗菌蛋白 seroin，研究發現中部及后部絲腺都能分泌這種蛋白[14-16]。SINGH 等[17]發現家蠶的seroin還具有抗病毒的活性。除了抗菌蛋白外，蠶絲中還有大量未知功能的蛋白質未被研究。【本研究切入點】近年來關于蠶絲蛋白組分與活性的研究已經取得了較多進展，然而關于蠶絲加工過程對于蠶絲組成與特性的影響仍然所知甚少。為了更好地開發和利用好蠶絲制品，有必要對蠶絲加工過程中絲蛋白成分的變化進行系統地研究。【擬解決的關鍵問題】采用不同方法對蠶絲進行脫膠處理，對脫膠后的蠶絲進行電泳檢測以及液相色譜-質譜聯用的蛋白質組學分析，并對經歷了不同加工過程的蠶絲產品進行電泳檢測與蛋白質組學分析，闡明各種脫膠方法及不同加工過程對蠶絲蛋白質成分與性質的影響，為蠶絲加工工藝的改進提供依據。

1 材料與方法

試驗于2014—2015年在西南大學完成。

1.1 材料與試劑

選取家蠶大造品種作為試驗對象，由西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室家蠶基因資源庫提供。幼蟲在25℃、相對濕度60%、自然光照條件下用桑葉進行飼喂，試驗材料為新鮮的蠶繭。生絲、胚綢、綢、緞、電力紡由西南大學席星航教授提供，使用多年的絲綢衣服由西南大學趙萍教授提供。木瓜蛋白酶、尿素、二硫蘇糖醇購于上海生工生物工程公司，碳酸鈉、氫氧化鈉購于成都科龍化工試劑廠，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術公司，超濾管和脫鹽柱購于密理博公司，胰蛋白酶、硫氰化鋰、碘乙酰胺和甲酸購于 Sigma公司。

1.2 蠶繭樣品的預處理與脫膠

將去掉繭網的蠶繭分為外層、中層和內層。選取中間層的蠶繭置于 65℃恒溫烘箱烘干，之后進行稱重，用5種方法對蠶繭進行脫膠處理。（1）木瓜蛋白酶脫膠法：將蠶繭置于 0.1%的木瓜蛋白酶溶液中（浴比為1:50），在60℃水浴鍋中水浴60 min；（2）尿素脫膠法：將蠶繭置于 8 mol·L-1尿素溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴75 min，取出脫膠液，將脫膠的蠶絲用 40℃溫水清洗 2次并盡量擰干，再放入新的8 mol·L-1尿素溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴60 min；（3）碳酸鈉脫膠法：將蠶繭置于0.5% Na2CO3溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴75 min，取出脫膠液，將脫膠的蠶絲用40℃溫水清洗2次并盡量擰干，再放入新的0.5% Na2CO3中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴60 min；（4）中性皂脫膠法：將蠶絲置于0.5%的中性皂液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴30 min，取出脫膠液，將脫膠的蠶絲盡量擰干，放入0.05% Na2CO3溶液中水浴20 min（浴比為1:100），取出脫膠液，將脫膠的蠶絲盡量擰干，再放入0.2% Na3PO4溶液中水浴60 min；（5）堿水脫膠法：將蠶繭置于含有NaOH的pH 11的純水溶液中（浴比為1:100），在100℃水浴鍋中水浴30 min。以上5種方法脫膠后取出脫膠液，并分別將脫膠后的蠶絲用40℃溫水清洗2次，于65℃恒溫烘箱中烘干。

1.3 蠶絲蛋白的提取、定量與電泳

稱取約0.01 g的未脫膠蠶繭、脫膠蠶繭或蠶絲制品放入1.5 mL離心管中，加入60% LiSCN溶液（1 g/100 mL）劇烈渦旋振蕩2 h，12000×g離心10 min，取上清，于-20℃保存。利用Brandford法測定蛋白濃度[18]。分別取 2 μg蠶絲蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并通過硝酸銀染色來分析提取的蠶絲蛋白。

1.4 蠶絲蛋白的質譜前處理

采取FASP（filter-aided sample preparation）酶解法對蠶絲蛋白進行溶液內酶解[19]，步驟如下：將150 μg蠶絲蛋白加入超濾管（MWCO 10 000，Millipore），用8 mol·L-1尿素溶液（UA）洗3次以置換LiSCN溶液，每次洗完后在12 000×g室溫離心20 min，除去離心下去的液體。加入15 mmol·L-1的二硫蘇糖醇溶液（DTT），37℃孵育 1 h，加入 15 μL 50 mmol·L-1的碘乙酰胺溶液（IAA），室溫避光反應1 h后，12 000×g室溫離心20 min，棄掉液體。用尿素溶液洗滌3次，以去除殘留的DTT和IAA，每次加入200 μL UA溶液。用50 mmol·L-1NH4HCO3溶液洗滌4次，以去除殘留的尿素溶液，12 000×g室溫離心20 min，棄掉液體，并更換新的離心管。在超濾管中按照1:50的質量比加入胰蛋白酶，于37℃酶解20 h。12 000×g室溫離心 20 min，回收管中酶解后的肽段溶液，4℃濃縮干燥，用0.1%甲酸水復溶后用Zip TipC18脫鹽柱脫鹽，然后在4℃濃縮干燥。

1.5 蠶絲蛋白的質譜鑒定

干燥后的肽段用0.1%甲酸水復溶，使用C18柱在EASY-nLC 1000系統（Thermo Fisher Scientific）上進行 140 min的色譜梯度分離。分離的肽段通過 Q Exactive質譜儀（Thermo Fisher Scientific）進行鑒定。質譜檢測使用TOP20原則。Full MS掃描的分辨率為70 000，MS2掃描的分辨率為17 500；Full MS的最大離子注入數為3e6，最大離子注入時間為20 ms，二級最大離子注入數為1e6，最大離子注入時間為60 ms。

利用MaxQuant（1.3.0.1版）軟件對獲得的數據進行數據庫搜索鑒定[20]。將家蠶基因組數據庫SilkDB（http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/）和 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）家蠶數據庫整合，構建本地數據庫（共包含35 379個蛋白質）。搜索引擎為Andromeda[21]。搜庫的參數設置如下，Mutiplicity=1，肽段 FDR（false discovery rate）=0.01，蛋白 FDR=0.01，可變修飾為Oxidations（M）和Acetyl（protein N-term），最小肽段的氨基酸數為6，切割酶為Trypsin，蛋白定量方法為 iBAQ。從得到的結果中手動去除污染序列和反向序列。

2 結果

2.1 不同方法脫膠后蠶絲蛋白的電泳檢測

目前常用的脫膠方法包括碳酸鈉法[22]、尿素法[23]、中性皂法[24-25]和蛋白酶法[26-27]等。為了觀察不同方法的脫膠效果，收集了各種方法的脫膠溶液與脫膠后的蠶絲纖維并進行蛋白電泳。從圖1的電泳結果可以看出，每種方法的第一次脫膠溶液中都能檢測到或多或少的蛋白質，而第二次脫膠溶液中幾乎檢測不到蛋白質，表明第一次脫膠處理就已經把容易脫掉的絲膠蛋白去掉了。電泳檢測脫膠后的蠶絲纖維可以發現不同方法處理后的纖維蛋白有著不同的分子量分布，表明絲素蛋白在脫膠過程中可能發生了不同程度的降解或殘留了不同量的絲膠蛋白。

圖1 脫膠溶液和脫膠后蠶繭絲的電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE of degummed solution and cocoon silk

木瓜蛋白酶法脫膠的溶液中只能檢測到小分子量的蛋白，但脫膠后的蠶繭中還能明顯地檢測到絲素重鏈和輕鏈，表明木瓜蛋白酶對絲膠蛋白具有較強的水解作用，而對絲素蛋白的水解作用較弱。碳酸鈉法脫膠溶液中能看到兩條明顯的絲膠條帶，脫膠后的蠶繭蛋白明顯比木瓜蛋白酶處理后的蠶繭蛋白分子量低，表明碳酸鈉溶液對絲膠的降解程度較弱，對絲素的降解程度較強。尿素脫膠溶液中存在拖帶的絲膠蛋白，脫膠后的蠶繭中能檢測到分子量明顯降低的絲素蛋白，表明尿素對絲膠蛋白和絲素蛋白的降解都比較嚴重（圖1-A）。中性皂液脫膠溶液和尿素脫膠溶液相似，能導致絲膠蛋白的降解，經過碳酸鈉和磷酸三鈉二次脫膠后，溶液中基本檢測不到蛋白，脫膠后的蠶繭中能檢測到分子量明顯降低的絲素蛋白。堿水脫膠溶液中只能檢測到少量的蛋白，表明脫膠效果不是很理想，脫膠后的蠶繭中存在大量的高分子量的絲素蛋白，降解不明顯（圖1-B）。

為了進一步比較不同方法的脫膠效果，將5種方法脫膠后的蠶繭與未脫膠的蠶繭一起進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果發現未脫膠的蠶繭、木瓜蛋白酶脫膠的蠶繭和堿水脫膠后的蠶繭蛋白的條帶較類似，能明顯地看到絲素重鏈和絲素輕鏈，并且絲素蛋白沒有出現明顯的降解；而尿素、碳酸鈉和中性皂脫膠后的蠶繭蛋白條帶類似，其絲素重鏈和輕鏈都出現了明顯的降解（圖2）。

圖2 脫膠后蠶繭絲蛋白的電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE of proteins in the degummed cocoon silk

2.2 不同方法脫膠后的蠶繭蛋白質組學分析

利用液相色譜質譜聯用的技術，對不同方法脫膠后的蠶繭進行蛋白質組學鑒定。共鑒定到159種蛋白，其中未脫膠蠶繭中鑒定到107種蛋白，堿水法脫膠后的蠶繭中鑒定到112種蛋白，木瓜蛋白酶法鑒定到64種蛋白，中性皂法鑒定到37種蛋白，碳酸鈉法鑒定到24種蛋白，尿素法鑒定到19種蛋白，表明這些脫膠方法的效果差異很大。堿水法的蛋白數目比未脫膠蠶繭的蛋白數目稍多，屬于實驗誤差，也暗示了堿水法效果最差。尿素法鑒定到的蛋白數目最少，表明尿素法的脫膠效果最好。

表1 脫膠后的蠶繭絲中主要蛋白質的信息列表Table 1 List of major proteins in the degummed cocoon silk

將未脫膠的蠶繭和5種脫膠方法處理的蠶繭蛋白組分進行非標定量比較分析，結果發現堿水法處理過的蠶繭和未脫膠蠶繭的蛋白組分相似，主要包括絲素重鏈、絲素輕鏈、絲素p25、絲膠1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制劑SPI51和SPI39等（表1）。木瓜蛋白酶法和中性皂法脫膠后的蠶繭中絲膠1蛋白幾乎消失，絲素蛋白的比例明顯增加，除了絲素蛋白外還含有seroin 1和甘氨酸富含蛋白等。碳酸鈉法和尿素法的脫膠效果最好，這兩種方法脫膠后的蠶繭中絲素蛋白是主要的成分，此外還含有甘氨酸富含蛋白，表明甘氨酸富含蛋白可能是絲素蛋白或最內層的絲膠蛋白（圖3）。

2.3 不同蠶絲產品中蛋白質的電泳檢測

為了檢測蠶絲工業實際加工過程對蠶絲成分的影響，選取了蠶絲加工獲得的各種產品，包括生絲、胚綢、綢、緞、電力紡和絲綢舊衣，提取其中的蛋白質進行電泳分析與質譜鑒定。通過電泳檢測可以看出，在生絲和胚綢中，絲素重鏈與絲素輕鏈的條帶都比較清晰；在綢、緞和電力紡中，絲素重鏈出現了部分程度的降解，絲素輕鏈的條帶也變得模糊；在絲綢舊衣中，絲素重鏈與輕鏈蛋白都出現了嚴重的降解，已經看不到清晰的蛋白條帶（圖4）。

圖3 脫膠的蠶繭絲中蛋白質的非標定量分析Fig. 3 Label-free quantitative analysis of proteins in the degummed cocoon silk

圖4 蠶絲產品中蛋白質的SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE of proteins from different silk products

2.4 不同蠶絲產品的蛋白質組學分析

利用液相色譜質譜聯用的技術，對工業上生產中獲得的各種蠶絲加工品進行了蛋白質組學分析。結果發現在生絲和胚綢中都能鑒定到近百種蛋白質（分別為95和100種），這與蠶繭的鑒定結果類似；但是，在綢、緞和電力紡中分別鑒定到了29、44和38種蛋白質，蛋白數量明顯減少；在使用多年的絲綢舊衣中只能鑒定到10種蛋白質；這些結果與各種方法脫膠后蠶絲蛋白的鑒定結果相似。在生絲和胚綢中，能檢測到大量蛋白質，主要成分包括3種絲素蛋白、絲膠1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制劑SPI51等（表2）；在綢、緞和電力紡中，主要成分包括3種絲素蛋白和seroin 1等（表2）；在使用多年的絲綢衣服中，仍然能鑒定到3種絲素蛋白和甘氨酸富含蛋白（圖5），這一結果與不同方法脫膠的結果類似（表2）。

3 討論

蠶絲作為紡織的原料已有5000年的歷史。經過長期的經驗積累和工藝改進，蠶絲的加工工藝已經十分成熟，主要包括脫膠和整理絲素等工藝。本研究參考已報道的多種脫膠方法，利用電泳檢測與質譜鑒定的方法，發現堿水法無法去掉絲膠，而其他4種方法都能有效地去除絕大部分的絲膠蛋白。木瓜蛋白酶法在去除絲膠的同時能夠最大程度地保持絲素纖維的完整性，這可能是由于蠶絲中的絲素蛋白疏水性強，形成高度有序排列的β折疊[28-29]，而絲膠是水溶性的糖蛋白，以無規則結構為主[30]。因此木瓜蛋白酶較容易作用于結構疏松的親水性絲膠，而很難作用于排列緊密的疏水性絲素。中性皂、碳酸鈉和尿素法會對絲素造成損傷，推測原因為這3種方法的處理溫度較高。這些結果表明完全脫掉絲膠是很困難的，采用劇烈的條件去除絲膠的同時會導致絲素蛋白的降解，進而導致蠶絲機械性能的降低[22]。之前有研究發現用尿素溶液在80℃溶解絲膠蛋白，當處理時間小于5 min時，能保持絲膠蛋白不降解[9,31]。這表明較劇烈的溶劑也可以保持絲蛋白的穩定性，但處理溫度不能太高，時間也不能太長。

表2 蠶絲加工產品中主要蛋白質的信息列表Table 2 List of major proteins in the different silk products

圖5 蠶絲加工產品中蛋白質的非標定量分析Fig. 5 Label-free quantitative analysis of proteins from different silk products

從蛋白種類上看，木瓜蛋白酶、中性皂、碳酸鈉和尿素 4種方法幾乎都能夠完全去除絲膠 1。木瓜蛋白酶和中性皂脫膠后，主要殘余絲素蛋白和seroin1蛋白，碳酸鈉和尿素脫膠后，殘余的蛋白主要是絲素蛋白和甘氨酸富含蛋白。之前的研究發現，seroin1蛋白在中部絲腺和后部絲腺都能合成，同時存在于絲素層與絲膠層中[14-16]。甘氨酸富含蛋白在中部絲腺中區和后區表達[12]，存在于絲膠的內層。這些結果表明 seroin1和甘氨酸富含蛋白可能存在于絲膠內層，因此多種脫膠方法都難以將這兩種蛋白除凈。

對多種蠶絲產品進行蛋白電泳檢測發現生絲和胚綢中的絲素蛋白比較完整，這可能是由于這兩者的加工時間較短，處理條件較溫和的緣故。綢、緞和電力紡由于經歷了后續更劇烈的條件，絲素蛋白已發生了部分降解，分子量明顯降低，力學性能也隨之降低。從蛋白成分與含量來看，生絲和胚綢中保留了很多種類的絲蛋白，包括絲素、絲膠1、seroin 1、osiris9a、甘氨酸富含蛋白、蛋白酶抑制劑和其他蛋白；而綢、緞和電力紡中主要是絲素和seroin 1。

4 結論

蠶絲的加工過程實質上是脫膠的過程。比較5種不同的脫膠方法發現，堿水脫膠的效果最差；木瓜蛋白酶脫膠法可以去掉大部分絲膠蛋白，同時最大程度地保持絲素纖維的完整性；中性皂、碳酸鈉和尿素法的脫膠程度都比較好，但是會對絲素造成損傷。比較5種蠶絲工業產品可以發現，蠶絲加工為生絲或胚綢后，絲膠蛋白含量很高，絲素纖維還很完整。蠶絲加工為綢、緞或電力紡后，絲膠蛋白基本被去除干凈了，但是絲素纖維已經出現部分程度的降解。

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