高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃芪護(hù)肝膠囊中7種活性成分的含量

紀(jì)國(guó)力 劉斌

[摘要]目的 建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定黃芪護(hù)肝膠囊中延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、五味子醇甲、大黃酚等主要成分含量的方法。方法 采用HPLC檢測(cè)黃芪護(hù)肝膠囊中延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、五味子醇甲、大黃酚等主要成分，色譜柱為CNW Athena C18型，流動(dòng)相為甲醇（A）和0.1%的磷酸水溶液（B），梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)中，延胡索乙素為210 nm，芍藥苷、橙皮苷和五味子醇甲為230 nm，丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚為265 nm。考察檢測(cè)黃芪護(hù)肝膠囊中各檢測(cè)成分的線性范圍、回收率和可重復(fù)性。結(jié)果 延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為1.26～25.20 μg/ml（r=0.9996）、7.03～140.60 μg/ml（r=0.9998）、3.63～72.60 μg/ml（r=0.9997）、2.11～42.20 μg/ml（r=0.9994）、1.98～39.60 μg/ml（r=0.9995）、3.10～62.00 μg/ml（r=0.9996）和2.28～45.60 μg/ml（r=0.9995），7種成分的平均加樣回收率（n=6）分別為99.6%、98.9%、98.7%、99.2%、98.2%、98.8%、98.2%，RSD分別為1.7%、1.0%、1.2%、1.5%、1.2%、1.2%、1.0%。結(jié)論 本方法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，回收率高，可用于黃芪護(hù)肝膠囊的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法；黃芪護(hù)肝膠囊；延胡索乙素；芍藥苷；橙皮苷；五味子醇甲；丹參酮ⅡA；大黃素

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）4（b）-0016-05

Simultaneous determination of 7 active components in Huangqi Hugan Capsules by high performance liquid chromatography

JI Guo-li LIU Bin▲

Tai′an Food and Drug Inspection and Testing Center，Shandong Province，Tai′an 271000，China

[Abstract]Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of main components of Tetrahydropalmatine，Paeoniflorin，Tanshinone ⅡA，Hesperidin，Emodin，Schisandrin A and Chrysophanol in Huangqi Hugan Capsules.Methods HPLC was used to detect the aforementioned components in Huangqi Hugan Capsules.The column was CNW Athena C18 and the mobile phase was methanol （A） and 0.1% aqueous solution of phosphoric acid （B） in gradient elution.The flow rate was 1.0 ml/min at 30℃ column temperature.The detection wavelength were 210 nm for Tetrahydropalmatine，230 nm for Paeoniflorin，Hesperidin and Schisandrin A，and 265 nm for Tanshinone ⅡA，Emodin，and Chrysophanol were 265 nm.The linear range，recovery，and repeatability of each component in Huangqi Hugan Capsules were examined.Results The linear ranges of Tetrahydropalmatine，Paeoniflorin，Hesperidin，Schisandrin A，Tanshinone ⅡA，Emodin and Chrysophanol were 1.26-25.20 μg/ml （r=0.9996），7.03-140.60 μg/ml （r=0.9998），3.63-72.60 μg/ml （r=0.9997），2.11-42.20 μg/ml （r=0.9994），1.98-39.60 μg/ml （r=0.9995），3.10-62.00 μg/ml （r=0.9996），and 2.28-45.60 μg/ml （r=0.9995）.The average recovery of 7 components （n=6） was 99.6%，98.9%，98.7%，99.2%，98.2%，98.8%，and 98.2%，respectively.RSD was 1.7%，1.0%，1.2%，1.5%，1.2%，1.2% and 1.0%，respectively.Conclusion The method is accurate and reproducible in a high recovery，which can be used for quality control of Huangqi Hugan Capsules.

[Key words]High performance liquid chromatography；Huangqi Hugan Capsules；Tetrahydropalmatine；Paeoniflorin；Hesperidin；Schisandrin A；Tanshinone Ⅱ A；Emodin

黃芪護(hù)肝膠囊是臨床常用的保肝藥物，是由多種中藥組成的復(fù)方制劑，其中包括赤芍、丹參、延胡索、大黃、陳皮等主要有效成分，用于慢性肝炎以及藥物性肝損傷等疾病的治療，其藥理作用復(fù)雜，如延胡索具有行氣、止痛、活血作用，其有效成分延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛、催眠、降低冠脈阻力及增加血疫調(diào)節(jié)等作用[3]；五味子具有補(bǔ)腎寧心、抗衰老等作用[4]；丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰止痛的作用；丹參酮ⅡA具有保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗氧化等作用[5]；大黃具有利濕瀉下、清熱瀉火等作用[6]，黃芪護(hù)肝膠囊的藥理藥效與其中中藥組分的活性成分密切相關(guān)。本研究就黃芪護(hù)肝膠囊中延胡索、赤芍、五味子、陳皮以及丹參和大黃中的有效藥理成分含量的測(cè)定方法進(jìn)行研究。

1儀器與試藥

1.1主要儀器

二極管陣列檢測(cè)器（SPD-M20A型，日本島津公司），高效液相色譜儀（LC-20AD型，日本島津公司），LC solution色譜工作站（日本島津公司），電子天平（十萬(wàn)分之一級(jí)，瑞士梅特勒公司）。

1.2試藥

芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201337），延胡索乙素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110726-201414），橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-201115），五味子醇甲對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110857-201211），自制黃芪護(hù)肝膠囊（批號(hào)為20141010、20140912、20141020）。大黃素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110756-200110），丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110766-200619），大黃酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110796-200716），其他試劑為分析純和純化水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）采用梯度洗脫（0～10 min，A 33%；10～20 min，A 33%～65%；20～30 min，A 65%；30～35 min，A 65%～78%；35～50 min，A 78%；50～55 min，A 78%～85%；55～60 min，A 85%；60～70 min，A 85%～33%）；大黃素、丹參酮ⅡA、大黃酚檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm；延胡索乙素檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，芍藥苷、五味子醇甲和橙皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃。延胡索乙素、大黃酚、芍藥苷、大黃素、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA理論塔板數(shù)均≥5000，分離度均>1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液和對(duì)照品溶液 精密稱取適量7種對(duì)照品，分別采用甲醇溶液制成質(zhì)量濃度為126、703、363、211、198、310、228 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液備用。然后精密適量量取各種儲(chǔ)備液，加甲醇制成含延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素、大黃酚分別為12.6、70.3、72.6、42.2、19.8、31.0、22.8 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 黃芪護(hù)肝膠囊研磨成均勻細(xì)末，采用電子天平稱取粉末1 g，錐形瓶?jī)?nèi)加入25 ml甲醇溶液及1 g黃芪護(hù)肝膠囊粉末，稱重后在功率頻率50 KHz、300 W條件下進(jìn)行超聲震蕩處理30 min，冷卻后采用甲醛溶液補(bǔ)重，應(yīng)用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

2.2.3陰性對(duì)照溶液 按照“2.2.1”中對(duì)照品溶液制備過(guò)程，分別制備不含有陳皮、延胡索、丹參、赤芍、延胡索和大黃單品的陰性對(duì)照溶液。

2.3空白試驗(yàn)

適量供試品、對(duì)照品及陰性對(duì)照溶液注入LC-20AD型高效液相色譜儀，參數(shù)設(shè)置如下。進(jìn)樣量：10 μl；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃。記錄色譜圖，分析檢測(cè)效果。結(jié)果顯示，供試品中延胡索乙素、五味子醇甲、橙皮苷、大黃素、大黃酚、芍藥苷、丹參酮ⅡA色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品一致，陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，提示黃芪護(hù)肝膠囊中延胡索、赤芍、五味子、陳皮以及丹參和大黃以外的其他中藥組分對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。HPLC圖譜見(jiàn)圖1～8。

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖1 對(duì)照品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖2 樣品HPLC色譜圖

2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖3 缺延胡索陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖4 缺赤芍陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖5 缺陳皮陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖6 缺五味子陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；6.大黃素；7.大黃酚

圖7 缺丹參陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA

圖8 缺大黃陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖

2.4線性關(guān)系考察

分別精密吸取延胡索乙素、芍藥苷、大黃素、大黃酚橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA，對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml，加甲醇溶液稀釋至10 ml，配置成梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃條件下分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。以濃度C（μg/ml）對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚的回歸方程分別為：A=4.295×104C+1.374×103（r=0.9996）、A=3.547×104C+3.584×103（r=0.9998）、A=2.236×104C+3.750×103（r=0.9997）、A=6.140×104C+3.366×103（r=0.9994）、A=4.119×104C+2.794×103（r=0.9995）、A=2.155×104C+3.462×103（r=0.9996）和A=3.447×104C+1.863×103（r=0.9995）。橙皮苷、延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、大黃酚、大黃素的線性范圍分別為3.63～72.60、1.26～25.20、7.03～140.60、1.98～39.60、2.11～42.20、2.28～45.60、3.10～62.00 μg/ml。

2.5精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，高效液相色譜儀進(jìn)樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察精密度。延胡索乙素、五味子醇甲、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.5%、0.6%、0.4%、0.7%、0.6%、0.5%和0.8%。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下，平行制備同一樣品（批號(hào)：20140912）6份，依法進(jìn)行測(cè)定，并分別計(jì)算含量，延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚的RSD分別為1.0%、0.6%、1.1%、0.8%、0.7%、1.0%和1.1%。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液分別在0、2、4、6、8、10、12 h依次進(jìn)行測(cè)定，延胡索乙素、芍藥苷、五味子醇甲、橙皮苷、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.8%、0.6%、0.8%、0.7%、1.0%、1.0%和1.2%。

2.8回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20140912）0.5g，共6份，分別精密加入延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚峰對(duì)照品貯備液1.0 ml，按照“2.2.2”步驟制成供試液，依次進(jìn)行加樣測(cè)定，計(jì)算各樣品回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品測(cè)定

取3批黃芪護(hù)肝膠囊樣品，按“2.2.2”步驟配制供試品溶液，進(jìn)樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，用外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中延胡索乙素、五味子醇甲、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、大黃酚含量（表2）。

3討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

黃芪護(hù)肝膠囊是中藥復(fù)方制劑，其中主要的重要組分有18種，赤芍、丹參、延胡索、大黃、陳皮等是主要的藥效成分，其中活性成分的含量對(duì)藥理藥效的發(fā)揮具有重要作用，而對(duì)于其中主要藥理成分的檢測(cè)是進(jìn)行質(zhì)控的方法之一，其中延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、五味子醇甲、大黃酚等是具有活性的主要藥理成分。為了能夠同時(shí)對(duì)其采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，選擇能夠適合多種組分的檢測(cè)波長(zhǎng)具有重要作用，如橙皮苷在207 nm和283 nm具有特征性的吸收峰，而在波長(zhǎng)230 nm時(shí)候延胡索乙素的吸收峰最強(qiáng)，在217 nm波長(zhǎng)條件下五味子醇甲的吸收峰最大，而在230 nm波長(zhǎng)時(shí)五味子醇甲的吸收峰也較強(qiáng)，而且分離度好，靈敏度高，能夠取得較好的檢測(cè)效果，因此以上幾種成分檢測(cè)過(guò)程中采用230 nm作為共同的檢測(cè)波長(zhǎng)能夠取得較為理想的效果。丹參酮ⅡA在224 nm和268 nm波長(zhǎng)處有特征吸收，大黃素在222 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且在252、265、289 nm波長(zhǎng)處有特征吸收，225 nm和256 nm波長(zhǎng)處大黃酚均具有特征性的吸收峰，但265 nm波長(zhǎng)處大黃酚也有較強(qiáng)吸收，而且檢測(cè)效果穩(wěn)定，靈敏度高，分離度好，無(wú)基線飄移，能夠取得較好的檢測(cè)效果，因此對(duì)于丹參酮ⅡA、大黃酚和大黃素的共同檢測(cè)波長(zhǎng)確定為265 nm。

3.2流動(dòng)相的選擇

既往的文獻(xiàn)研究顯示[7-15]，甲醇-磷酸鹽溶液、甲醇-水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液及甲醇-0.1%磷酸溶液在檢測(cè)過(guò)程中均可作為流動(dòng)相。研究結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相能夠取得較好的分離效果，檢測(cè)物的吸收峰對(duì)稱且較為尖銳，吸收峰的形態(tài)較為理想，理論搭板數(shù)更高。黃芪護(hù)肝膠囊中的成分較為復(fù)雜，檢測(cè)物質(zhì)的性狀存在較大的差別[16-20]，為了獲取較好的檢測(cè)效果，使各檢測(cè)物的色譜峰分離度更好，出峰時(shí)間更合理，通過(guò)梯度洗脫的方法，對(duì)甲醇和0.1%磷酸溶液配比的不斷調(diào)整，對(duì)載液的極性、離子強(qiáng)度等不斷優(yōu)化，使得檢測(cè)物質(zhì)均能獲得良好的吸收峰，而且無(wú)雜質(zhì)峰形成及干擾，獲得較好的效果。

3.3供試品溶液制備方法的選擇

為了考察不同溶劑以及不同方法提取效果，分別采用超聲提取和回流提取，并且在提取過(guò)程中采用70%甲醇溶液、乙醇溶液和甲醇溶液作為溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚等7種檢測(cè)物在甲醇溶液中較為穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾小，提取效果較好，對(duì)不同的提取技術(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，超聲提取的效果比回流提取的效果要好，采用甲醇為溶液、采用超聲提取30 min能夠獲得最好的提取效果。綜合評(píng)定，采用本研究中的方法測(cè)定黃芪護(hù)肝膠囊中的7種有效成分重復(fù)性好，回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確，而且操作簡(jiǎn)便，適宜于在黃芪護(hù)肝膠囊的質(zhì)量控制中使用。

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（收稿日期：2018-01-15 本文編輯：祁海文）