連續性血液透析濾過對急性重癥胰腺炎大鼠腸上皮細胞凋亡和腸功能障礙的影響

王 鋒，劉 杰,黃仲俊

(1. 湖北省丹江口市第一醫院,湖北 丹江口 442700；2. 湖北醫藥學院附屬人民醫院，湖北 十堰 442000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)屬于臨床中發生率較高的急危重癥之一，具有發病迅速、疾病進展快、致死率高等特點[1]。SAP發病不僅限于胰腺本身，往往還會累及包括腸道在內的全身多個臟器，腸黏膜屏障功能受損，表現為細胞非正常凋亡增加，而上皮細胞增殖與凋亡之間的動態平衡決定了腸黏膜上皮功能能否處于穩定狀態[2-3]。已有報道指出，連續性血液透析濾過能夠非選擇性的清除炎癥遞質，保持血流動力學處于相對穩定的狀態，用于治療多臟器功能不全等疾病療效較好[4-5]。本研究通過將5%牛磺膽酸鈉逆行注射于大鼠膽管制備SAP模型后采取連續性血液透析濾過進行干預，旨在探討連續性血液透析濾過對SAP大鼠腸上皮細胞凋亡和腸功能障礙的影響。

1 實驗資料

1.1實驗動物與分組 選擇SPF級SD大鼠54只，體質量280～300 g。將54只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、血液透析濾過組，每組18只。

1.2實驗方法 術前全部大鼠禁食12 h，自由飲水；腹腔內注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠；固定、消毒、上腹正中切口剖腹，于十二指腸內側見片狀分布的胰腺，模型組和血液透析濾過組用無損傷動脈夾夾閉肝門部膽管，從膽胰管開口十二指腸系膜緣對側腸壁穿刺扎入導管，導管插入膽胰管約1 cm，逆行注射5%牛磺膽酸鈉溶液(0.1 mL/100 g， 0.1 mL/min)，推注完畢后用無損傷動脈夾夾閉。10 min后，去除動脈夾，縫合。假手術組僅做剖腹術，并輕翻動胰腺組織后關腹。關腹后，假手術組和模型組大鼠皮下注射生理鹽水。血液透析濾過組大鼠術后立刻給予連續性血液透析濾過12 h，方法：采用智能化床旁腎臟替代治療機(瑞典PRISMA-TM型)和AN-69型血濾器(可濾分子范圍20～30 000 D，膜面積0.9 m2)，選用股靜脈留置單針雙腔導管建立血管通路，透析液流速2 500 mL/h，血流量180 mL/min，置換液流速2 000 mL/h；采用濾器前肝素抗凝法，用生理鹽水(含5 000 IU/L肝素)1.5 L預沖，首次肝素劑量1 000 IU/kg，后續肝素劑量2 kIU/h。

1.3檢測指標 分別于術后12 h、24 h、48 h每組各處死6只大鼠，取門靜脈血，采用鱟試劑定量動態比濁法檢測血漿內毒素含量；取腸黏膜組織，采用免疫組化法檢測凋亡因子Apaf-1、Bcl-2陽性表達率和腸黏膜上皮細胞凋亡指數；取各組大鼠胰腺、腹水、腸系膜淋巴結以及肝臟組織，進行細菌培養。上述操作全部遵循無菌原則。

2 結 果

2.13組大鼠術后各時間點腸黏膜上皮細胞凋亡因子表達情況 假手術組術后各時間點Apaf-1、Bcl-2陽性表達率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。術后12 h，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達率均明顯高于假手術組(P均<0.05)，Bcl-2陽性表達率均明顯低于假手術組(P均<0.05)；隨著距離手術時間的增加，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達率均呈下降趨勢，但仍高于假手術組(P均<0.05)；Bcl-2陽性表達率呈增高趨勢，但仍低于假手術組(P均<0.05)。血液透析濾過組術后各時間點Apaf-1陽性表達率均明顯低于模型組(P均<0.05)，Bcl-2陽性表達率均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠術后各時間點Apaf-1、Bcl-2陽性表達率比較

注：①與假手術組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠術后各時間點腸黏膜上皮細胞凋亡指數比較 假手術組術后各時間點腸黏膜上皮細胞凋亡指數比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；模型組術后各時間點腸黏膜上皮細胞凋亡指數均明顯高于假手術組與血液透析濾過組(P均<0.05)；隨著距離手術時間的增加，模型組和血液透析濾過組腸黏膜上皮細胞凋亡指數均呈下降趨勢；術后24 h、48 h，血液透析濾過組腸黏膜上皮細胞凋亡指數與假手術組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠術后各時間點腸黏膜上皮細胞凋亡指數比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

2.33組大鼠術后各時間點門靜脈血漿內毒素含量比較 假手術組術后各時間點門靜脈血漿內毒素含量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；模型組術后各時間點門靜脈血漿內毒素含量均明顯高于假手術組與血液透析濾過組(P均<0.05)；隨著距離手術時間的增加，血液透析濾過組血漿內毒素含量呈下降趨勢，術后24 h、48 h時血漿內毒素含量與假手術組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 3組大鼠術后各時間點門靜脈血漿內毒素含量比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

2.43組大鼠各時間點細菌培養情況比較 假手術組大鼠術后各時間點均未發現陽性細菌；在胰腺、腹水、腸系膜淋巴結以及肝臟中，血液透析濾過組各時間點細菌培養陽性率均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表4。

表4 模型組與血液透析濾過組大鼠各時間點細菌培養陽性率比較 %

注：①與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

SAP發病兇險，機體處在嚴重的應激狀態下，氧自由基、繼發腸道缺氧缺血以及各種炎癥因子大量生成，破壞了腸黏膜上皮，導致腸黏膜屏障功能損傷[6]；且SAP發生后往往伴隨持久且嚴重的腸麻痹，而細菌發酵產氣以及腸內容物的停滯可導致腸內壓力增高，造成黏膜血流降低以及黏膜損傷，具體表現在腸黏膜的形態學發生變化、腸黏膜通透性增加以及腸道細菌與內毒素發生移位[7-9]。其中腸黏膜屏障功能損傷的主要分子生物學基礎之一即腸黏膜上皮細胞凋亡增加。在線粒體的凋亡過程中，Apaf-1是其中主要的促凋亡因子之一。死亡刺激直接誘導線粒體內膜間的細胞色素C釋放入胞質中，胞漿中的Apaf-1與細胞色素C相結合，Apaf-1寡聚化后募集procaspase-9，共同組成凋亡體，最終引起細胞發生不可逆轉的凋亡[10-11]。Bcl家族蛋白在細胞凋亡過程中扮演著重要角色，其中Bcl-2是線粒體凋亡過程中主要抑凋亡因子之一，其可通過在線粒體質膜上結合，對線粒體起到穩定作用[12]。

本研究結果顯示，術后12 h，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達率和腸黏膜上皮細胞凋亡指數均明顯高于假手術組、Bcl-2陽性表達率明顯低于假手術組，說明在SAP早期腸黏膜上皮細胞即發生了嚴重凋亡；隨著距離手術時間的增加，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達率和腸黏膜上皮細胞凋亡指數呈下降趨勢，Bcl-2陽性表達率呈增加趨勢，血液透析濾過組腸黏膜上皮細胞凋亡指數接近假手術組。血液透析濾過組術后各時間點門靜脈血漿內毒素含量和胰腺、腹水、腸系膜淋巴結、肝臟中細菌培養陽性率均明顯低于模型組，說明腸黏膜屏障功能出現障礙時，其腸上皮細胞之間的間隙增加，最終發生細菌以及內毒素移位，而給予連續性血液透析濾過干預可明顯緩解腸道內毒素以及細菌移位情況。

綜上所述，連續性血液透析濾過能夠抑制急性重癥胰腺炎大鼠腸上皮細胞通透性，可有效改善腸功能障礙，并具有抑制內毒素與細菌移位的作用。連續性血液透析濾過改善腸功能的作用機制可能是其可清除腸道內的內毒素以及細菌，從而調節腸道內部微生態的失衡，保障了腸道機械屏障的完整。

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