甘藍(lán)型油菜BnMYB1基因克隆及其對非生物脅迫的響應(yīng)

樊 溢，劉 明，王景雪

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

MYB蛋白是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]。目前MYB轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)從許多植物中克隆和鑒定出來，其中在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有超過196個(gè)MYB基因，玉米有超過157個(gè)MYB基因[2-3]。MYB蛋白含有1～3個(gè)串聯(lián)的、不完全重復(fù)的MYB結(jié)構(gòu)域（R1，R2和R3）。每個(gè)結(jié)構(gòu)域由51～52個(gè)氨基酸序列組成。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同，將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為3類，分別為：R1-MYB，R2R3-MYB和R1R2R3-MYB[4]。其中，R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子是目前研究最為廣泛的一類MYB轉(zhuǎn)錄因子，其含有R2和R3等2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)保守的色氨酸殘基起著疏水核心的作用，主要參與調(diào)控植物發(fā)育、代謝和對生物與非生物脅迫的反應(yīng)等多種生理過程[5-7]。以往的研究表明，MYB蛋白在植物對逆境脅迫的響應(yīng)上有著重要作用[8]。

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是我國乃至全世界重要的油料作物。菜籽油不僅是優(yōu)質(zhì)的食用油，也是重要的工業(yè)原料和生物能源，大力發(fā)展油菜產(chǎn)業(yè)有助于保障我國的糧油安全，促進(jìn)農(nóng)民增收，還能為我國能源安全戰(zhàn)略作出重要貢獻(xiàn)。然而，由于全世界范圍內(nèi)土地干旱和土壤鹽漬化的趨勢愈加嚴(yán)重，油菜生產(chǎn)也面臨著日益嚴(yán)重的干旱威脅。干旱、土壤鹽漬化會引起油菜形態(tài)、生理生化及分子水平等一系列的變化，導(dǎo)致產(chǎn)量下降[9-10]；賀亞軍等[11]通過對甘藍(lán)型油菜耐鹽相關(guān)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子與油菜的耐鹽性相關(guān)。

本研究以甘藍(lán)型油菜晉油4號為試驗(yàn)材料，并從其葉片組織中克隆到了編碼BnMYB1轉(zhuǎn)錄因子的基因，檢測其在不同組織部位的表達(dá)量，并測定其在應(yīng)對不同非生物脅迫下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究BnMYB1基因的功能和利用BnMYB1基因選育油菜新品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以甘藍(lán)型油菜晉油4號為試驗(yàn)材料。晉油4號種子由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所油菜育種研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增Bn－MYB1基因 本研究利用NCBI已發(fā)表的BoMYB1基因（GenBank登錄號：GU219985.1），根據(jù)其序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)ORF保守區(qū)上下游引物BoMYB1-F：5′-CGGGATCCATGGAGGATTCGT-3′和 BoMYB1-R：5′-AACTGCAGCTAATCAAGTTCTA CAG-3′，利用CTAB法提取晉油4號葉片組織基因組，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，72℃終延伸 10 min，共30個(gè)循環(huán)；4℃下保存。

1.2.2 BnMYB1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與測序PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將產(chǎn)物條帶從膠上切下，按照SanPre柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工生物工程公司）的步驟進(jìn)行回收。將回收的PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T（TakaRa）載體上。將10 μL重組質(zhì)粒加到100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中輕搖勻，冰上放置30 min后42℃水浴熱激90 s，加入1 mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基于37℃，180 r/min復(fù)蘇2 h，然后將菌液涂布到含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上37℃過夜倒置培養(yǎng)，次日挑選單菌落進(jìn)行陽性克隆鑒定。按照SanPre柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（上海生工生物工程公司）步驟進(jìn)行質(zhì)粒抽提，進(jìn)行PCR鑒定，確定為陽性后，將抽提的質(zhì)粒使用M13通用引物送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測序?？寺〉玫降幕蛎麨?BnMYB1（KP296768）。

1.2.3 BnMYB1轉(zhuǎn)錄因子基因序列生物信息學(xué)分析 將測序結(jié)果進(jìn)行一系列生物信息學(xué)分析，使用NCBI上的ORF finder程序推導(dǎo)目的基因的氨基酸序列；通過 ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析相對分子量、等電點(diǎn)及疏水性等理化性質(zhì)；采用SignalP4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽預(yù)測和蛋白亞細(xì)胞定位；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpr ed_sopma.pl）進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用ProtFun（https://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）進(jìn)行蛋白功能預(yù)測；利用 Motif Scan（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan#GRAPHIC）進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域的分析；利用clustal 1.81軟件進(jìn)行多序列比對，結(jié)合MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 BnMYB1轉(zhuǎn)錄因子在油菜幼苗不同組織部位中的表達(dá)分析 在人工氣候室內(nèi)種植油菜，生長28 d后，分別取幼苗的根、莖、葉組織，使用Trizol（TaKaRa）提取總 RNA，使用 PrimeScript RT gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，將油菜Actin基因的相對擴(kuò)增作為內(nèi)部對照。利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)Bn－MYB1和Actin基因的上下游引物。BnMYB1：F5′-AGGATTCGTCCAAAGGGTT-3′；R5′-AGCTGGGCT TAATAGGTGTAGG-3′。Actin：F5′-CCCTGGAATT GCTGACCGTA-3′；R5′-TGGAAAGTGCTGAGGGAT GC-3′。qRT-PCR 反應(yīng)條件為：95℃，15min；94℃，10 s，57 ℃，15 s，72 ℃，20 s，共 40 個(gè)循環(huán)。

1.2.5 油菜幼苗非生物脅迫種類及處理方法 在油菜幼苗期，本研究選取了鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫和水楊酸處理等4種非生物脅迫，分別對油菜幼苗進(jìn)行不同處理，不同處理時(shí)間下采葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用1.2.4的所列引物，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，檢測BnMYB1基因在各種脅迫下的表達(dá)量。

1.2.5.1 鹽脅迫試驗(yàn) 油菜種子在室內(nèi)23℃條件下發(fā)芽，待油菜生長28 d后進(jìn)行鹽脅迫。具體方法：對油菜幼苗停止正常澆水，使用200 mmol/L NaCl溶液，對幼苗進(jìn)行高鹽處理，用等量蒸餾水處理作為對照。在 0.5，1，4，8，16，24，48，72 h 后分別取葉片進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5.2 干旱脅迫試驗(yàn) 油菜種子在室內(nèi)23℃條件下發(fā)芽，待油菜生長28 d后進(jìn)行干旱脅迫。具體方法：對幼苗停止正常澆水，代之澆含有200 g/L PEG-6000的水溶液，進(jìn)行模擬干旱試驗(yàn)，用等量蒸餾水處理作為對照。在 0.5，1，4，8，16，24，48，72 h后分別取葉片進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5.3 冷脅迫試驗(yàn) 油菜種子在室內(nèi)23℃條件下發(fā)芽，待油菜生長28 d后進(jìn)行冷脅迫處理。具體方法為：將幼苗置于4℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行冷脅迫處理，在 0.5，1，4，8，16，24，48，72 h 后分別取葉片進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5.4 水楊酸處理 油菜種子在室內(nèi)23℃條件下發(fā)芽，待油菜生長28 d后進(jìn)行水楊酸處理。具體方法：對油菜幼苗停止正常澆水，葉面噴施5 mmol/L水楊酸，以噴施等量蒸餾水作為對照，噴施后0.5，1，4，8，16，24，48，72 h 分別采取葉片進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜BnMYB1基因克隆與分析

用設(shè)計(jì)的基因全長引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出大小約1 300 bp的目的條帶（圖1），與預(yù)測結(jié)果大小一致。把回收的目的條帶構(gòu)建入pMD19-T載體，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、鑒定后，提取質(zhì)粒送上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

2.2 甘藍(lán)型油菜BnMYB1基因序列分析

序列測定結(jié)果分析表明，BnMYB1基因全長為1 393 bp，經(jīng)NCBI中ORF finder推導(dǎo)出目的基因的氨基酸編碼序列為1個(gè)753 bp的開放閱讀框，編碼250個(gè)氨基酸。經(jīng)過比對分析，BnMYB1屬于典型的R2R3-MYB亞家族，其N端含有R2，R3等2個(gè)保守的MYB結(jié)構(gòu)域，R2和R3分別由51，50個(gè)氨基酸組成，R2結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)色氨酸（W），色氨酸之間有18～19個(gè)氨基酸間隔（圖2），R3含有2個(gè)色氨酸，第1個(gè)色氨酸被亮氨酸（L）所取代。ProtParam預(yù)測結(jié)果表明，BnMYB1蛋白分子量為21.4 ku，等電點(diǎn)為9.13，平均親水性系數(shù)（GRAVY）為-0.426，親水氨基酸數(shù)占總氨基酸數(shù)的83.2%，故可推測BnMYB1蛋白為小分子親水性蛋白；根據(jù)SignalP4.1 Server信號肽預(yù)測結(jié)果表明，BnMYB1所編碼的蛋白不存在信號肽，亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示該蛋白定位于細(xì)胞核中；BnMYB1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由62個(gè)α-螺旋（24.8%），31個(gè)延伸鏈（12.4%），150個(gè)無規(guī)則卷曲（60.16%）組成。生物學(xué)功能預(yù)測顯示，BnMYB1蛋白具有合成輔酶因子、嘌呤、嘧啶和能量代謝、脂肪酸代謝等方面的功能（表1）。Motif Scan軟件分析序列含有一個(gè)核定位序列（NLS），其作用與入核載體相互作用使BnMYB1蛋白被運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。

表1 BnMYB1編碼蛋白功能預(yù)測

2.3 BnMYB1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹構(gòu)建

將來自不同物種的、與非生物逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子序列（包括：AtMYB30（822525），AtMYB96 （836367），AtMYB60（837403），OsMYB4（LOC4336407），TaMYB33（LOC100859950），GmMY-B92（DQ822903.1），ZmMYBZ2（DQ902861），PeMYB2（HM747940.1），ShMYB18 （ACT98139.1），CmMYB2（JF795918））與克隆得到的BnMYB1基因利用clustal 1.81軟件進(jìn)行多序列比對后，結(jié)合MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，BnMYB1和其他作物逆境相關(guān)的R2R3-MYB蛋白表現(xiàn)出不同程度的相似性（圖 3）。在擬南芥中，AtMYB60[12]和 At－MYB96[13]參與干旱脅迫，能調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)并影響根的生長；小麥中TaMYB33的過表達(dá)可以促進(jìn)滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的合成，從而提高小麥的耐鹽和耐旱性[14]。TaMYB32同樣受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中超表達(dá)TaMYB32，TaMYB33基因，均可使植株的耐鹽能力有所增強(qiáng)[15]。BnMYB1與大豆Gm－MYB92處于同一分支，且轉(zhuǎn)GmMYB92基因的擬南芥中，植株表現(xiàn)出更好的耐鹽耐凍性[16]。因此，推測BnMYB1同樣具有參與響應(yīng)高鹽、干旱脅迫的功能。

2.4 BnMYB1轉(zhuǎn)錄因子在油菜幼苗不同組織中的表達(dá)特征分析

晉油4號幼苗期分別取其根、莖、葉組織，提取其總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用設(shè)計(jì)的qRT-PCR引物，對BnMYB1在甘藍(lán)型油菜幼苗根、莖、葉中的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。從圖4可以看出，BnMYB1在油菜根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)最高，是根中表達(dá)量的15倍以上，而在根中的表達(dá)量最低。因此，推測BnMYB1對水分脅迫的響應(yīng)主要是減少葉片對水分的蒸騰。

2.5 甘藍(lán)型油菜BnMYB1對非生物脅迫的響應(yīng)分析

取生長28 d的甘藍(lán)型油菜幼苗，分別進(jìn)行脅 迫處理，對照組用等量蒸餾水進(jìn)行處理，分別提取不同處理的葉片總RNA，用qRT-PCR法分析其相對表達(dá)量。結(jié)果表明，在4種脅迫處理下，BnMYB1基因的表達(dá)量由于受外界瞬時(shí)刺激，在0.5 h時(shí)均處于較低狀態(tài)。在高鹽脅迫處理16 h內(nèi)其表達(dá)量呈上升趨勢，在處理16 h時(shí)BnMYB1基因表達(dá)明顯上調(diào)，表達(dá)量最大，是對照的2.4倍，24 h后基因的表達(dá)低于對照，說明高鹽脅迫誘導(dǎo)了BnMYB1轉(zhuǎn)錄因子基因的大量表達(dá)（圖5-A）。

在PEG-6000模擬干旱脅迫下，BnMYB1基因在4 h內(nèi)表達(dá)量迅速升高，4 h的表達(dá)量最高，為對照的3.7倍，之后隨處理時(shí)間的增加，相對表達(dá)量逐漸減小，處理16～24 h其表達(dá)量接近對照且無顯著差異（圖5-B）。說明BnMYB1基因受干旱脅迫誘導(dǎo)，參與了油菜對水分脅迫的應(yīng)答。

在4℃冷脅迫處理1～8 h內(nèi)，BnMYB1基因表達(dá)量有升高趨勢，在處理16 h時(shí)表達(dá)量水平最高，為對照的2.5倍；24 h后BnMYB1基因表達(dá)量均低于對照（圖5-C）。水楊酸處理后，BnMYB1基因的表達(dá)量在1 h時(shí)略有升高，為對照的1.2倍，之后隨處理時(shí)間增加，BnMYB1基因的表達(dá)量逐漸降低（圖5-D）。

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，MYB作為植物體內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物次生代謝、器官的形成，調(diào)節(jié)激素和環(huán)境因子的應(yīng)答、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期[17]，尤其是R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)非生物脅迫方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。油菜中關(guān)于MYB研究主要集中于花藥發(fā)育和花粉形成等方面[18]，而關(guān)于MYB基因在油菜抗逆方面的研究較少。本研究從甘藍(lán)型油菜晉油4號中克隆得到BnMYB1基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于典型的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子。已有研究證明，R2R3結(jié)構(gòu)域在植物抵御非生物逆境脅迫方面有重要作用。

利用qRT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，BnMYB1在油菜根、莖、葉中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量較高。在高鹽、干旱、冷脅迫處理下，BnMYB1在葉中的表達(dá)量均有增高，表明油菜在應(yīng)對非生物脅迫過程中BnMYB1發(fā)揮重要的作用。水楊酸作為植物內(nèi)普遍存在的內(nèi)源信號分子，主要參與植物對病原的防御反應(yīng)。有研究表明，煙草的Myb1基因在受到外界水楊酸刺激后表達(dá)量增高，抗病蛋白隨之增高，表明煙草Myb1在植物的抗病反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用[19]。本研究在對油菜外施水楊酸后，BnMYB1表達(dá)量升高，推測其可能也參與抗病蛋白基因的激活和植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)。

植物對環(huán)境脅迫如干旱的抗性是受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀。因此，單一基因的改變往往對這些性狀影響有限，而MYB轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控其下游的一系列基因而共同作用，從而調(diào)節(jié)植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)[20]?；谇叭搜芯堪l(fā)現(xiàn)，植物在逆境影響下，R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量會發(fā)生明顯變化，這一變化預(yù)示著這類轉(zhuǎn)錄因子將調(diào)控下游抗逆性基因的表達(dá)[21]，SHAN等[22]從菊花中克隆得到R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子CmMYB2基因，可以調(diào)控逆境相關(guān)基因的表達(dá)，在植株應(yīng)對干旱和高鹽脅迫過程中起到關(guān)鍵作用；肖冬長等[23]從毛竹中克隆得到R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子PeMYB2基因，其在擬南芥中的過表達(dá)可使植株對鹽脅迫有更高的耐性。本研究獲得的BnMYB1基因參與了逆境脅迫的響應(yīng)，其作為轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控下游基因表達(dá)需要進(jìn)一步研究。

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