中華鱉fut2基因的克隆及其組織表達模式分析

邢 瀟，宋如昕

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

動物腸道既要防止腸道菌群的入侵，同時也要避免對腸道微生物過度免疫反應，因此，腸道微生物的種類和數目要維持一個平衡狀態[1]。但是有眾多的理化與病理因素可能使腸道微生物異常，例如抗生素、飲食結構的改變以及各種脅迫均會導致腸道菌群結構發生改變[2-4]。腸道微生物可以影響宿主的代謝、營養吸收和免疫功能，菌群的失衡會給宿主的健康帶來嚴重影響。研究表明，腸道菌群可以通過腸-腦軸對宿主的應激反應、焦慮、抑郁和認知功能造成重要影響[5-7]。因此，中華鱉腸道菌群的失衡會嚴重制約中華鱉的健康生產，從而對中華鱉養殖戶造成巨大的經濟損失。

巖藻糖基轉移酶（fucosyltransferase，FUTs）能夠催化巖藻糖的形成，主要表達在胃腸黏液腺中[8]。巖藻糖能夠決定組織血型抗原的形成，是多種腸道微生物的黏附受體[9-10]。因此，FUT2的缺失或異常表達會影響組織血型抗原的表達，從而影響腸道細菌的組成，嚴重影響宿主的代謝和免疫等功能。

本研究利用PCR技術擴增中華鱉fut2基因的cDNA全長序列，通過生物信息學分析預測fut2相關理化性質，同時用Real-time PCR技術分析fut2基因在中華鱉不同組織中的表達差異，旨在為將來研究fut2基因打下基礎，對于中華鱉人工養殖產業的發展以及資源的恢復具有一定的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

中華鱉購自河北省玉田縣中華鱉養殖場，買回后在實驗室馴養14 d，每日進行一次換水喂食，水溫用加熱棒控制在（25±1）℃，取材方法同宋如昕等的方法[11]。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的反轉錄 RNA的提取采用山西大學生命科學學院非生物脅迫的細胞分子生物學效應與適應生物學實驗室總結的方法[12]，用Trizol提取。采用紫外分光光度計測量RNA的濃度，將合格的RNA樣品調成統一濃度，將其放入超低溫冰箱中保存，隨后用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。

1.2.2 中華鱉fut2基因cDNA全長的獲得 對中華鱉fut2基因序列進行預測，在保守區設計引物并合成。使用SMARTer RACE cDNA擴增試劑盒，以中華鱉的混合樣品cDNA為模板進行RACE。RACE產物跑膠檢測，對預測的fut2條帶進行切膠回收，連接到載體上，然后轉化，挑單克隆培養，菌液PCR篩選后測序，測序結果在BioEdit中進行拼接，根據拼接得到的序列設計fut2 cDNA全長驗證引物，經驗證后獲得中華鱉fut2 cDNA全長序列。

1.2.3 生物信息學分析 在NCBI的Blastp中對中華鱉fut2進行同源性比對；使用Signal P 4.1 server預測信號肽；蛋白質二級結構采用SOPMA在線軟件預測，相似性以及一致性利用NCBI數據庫分析。用ORF Finder推測其ORF及所編碼的氨基酸序列；在ProtParam tool中分期FUT2氨基酸序列的等電點和親水性；跨膜結構的分析則用TMHMM軟件；利用SMART數據庫分析結構域；用中華鱉fut2的氨基酸序列與其他動物的蛋白序列進行比對。采用ClustalX軟件和MEGA 6.0軟件，構建中華鱉FUT2氨基酸序列的系統進化樹。蛋白3D結構預測采用同源建模法，用SWISS-MODEL在線軟件完成。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 根據獲得的中華鱉fut2基因的全長，熒光定量引物fut2 Fwd，fut2 Rev（表1）在Primer 3.0在線軟件中進行設計。以反轉錄各組織的cDNA為模板，ef1α為內參基因。反應體系為：去離子水 3.75 μL，正向引物 0.375 μL，反向引物 0.375 μL，SYBR 7.5 μL。使用熒光定量PCR 儀檢測 Ct值，用 2-ΔΔCt法對結果進行分析，計算各個基因的相對表達量，通過Graphpad軟件對數據進行處理并導出柱狀圖。

表1 引物序列

1.3 數據統計分析

數據處理和柱狀圖的繪制使用Graphpad軟件，統計分析采用SPSS 17.0軟件，差異顯著水平檢驗采用單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著水平設為P＜0.05（任何2組含有同一字母，表示該2組之間差異不顯著，反之，則表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

將測序結果拼接獲得完整的中華鱉fut2基因，全長 1 918 bp，其中，5′非編碼區（5′-UTR）380 bp，3′非編碼區（3′-UTR）518 bp，開放閱讀框長度為1 020 bp，編碼339個氨基酸殘基。分析顯示，中華鱉FUT2包含FUT核心結構，屬于O-FucT-like蛋白家族（圖1）。

ProtParam tool分析表明，FUT2蛋白分子量為3.9 ku，理論等電點為8.99。帶有負電的氨基酸殘基為31個（Asp和Glu），帶有正電的氨基酸殘基為36個（Arg和 Lys），不穩定系數為 48.45，總平均親水性為-0.273，脂溶指數為79.09。

采用Signal P 4.1 Server預測蛋白質序列中的信號肽的剪切位點,結果顯示,中華鱉fut2基因編碼的蛋白不含有信號肽。通過Target P 1.1 server進行導肽查找，結果顯示，線粒體目標肽及分泌途徑信號肽分別為 0.129（mTP）和 0.882（SP），預測可靠性為2，推測該序列不是定位于線粒體。使用TMHMM在線軟件進行分析可知，fut2基因翻譯的蛋白質結構中有1個跨膜結構,位于第13～32位氨基酸（圖2）。利用SMART數據庫對結構域檢測分析顯示，FUT2包含一個Glyco_transf_11結構域。

FUT2蛋白的二級結構主要由α螺旋和無規則卷曲組成，分別占46.90%和28.32%。同時在SWISS-MODEL網構建了中華鱉FUT2蛋白的3D模型，如圖3所示。

2.2 中華鱉fut2基因的同源性分析

GenBank數據分析顯示（表2），中華鱉FUT2與揚子鱷（Alligator sinensis）的相似性（87%）、一致性（81%）最高，與西部錦龜（Chrysemys picta bellii）的相似性為87%、一致性為79%，與安樂蜥（Anolis carolinensis）的相似性為86%、一致性為74%，與綠海龜（Chelonia mydas）的相似性為84%、一致性為76%，與壁虎（Gekko japonicus）的相似性為 79%、一致性為76%，與小鼠（Mus musculus）的相似性為79%、一致性為69%，與人（Homo sapiens）的相似性為76%、一致性為65%。將中華鱉的FUT2氨基酸序列與其他幾種脊椎動物FUT2氨基酸序列對比得出，中華鱉FUT2氨基酸序列相對較保守（圖4）。

表2 中華鱉FUT2編碼氨基酸與其他物種的相似性和一致性分析結果

采用鄰接法構建的系統進化樹表明（圖5），中華鱉FUT2單獨聚為一支，再與西部錦龜和綠海龜聚為一支，然后與揚子鱷聚在一起，再與壁虎和安樂蜥聚在一起，它們同屬于脊索動物門爬行綱，而與小鼠和人親緣關系較遠。說明中華鱉fut2基因的分子進化地位與其生物學分類大體一致。

2.3 中華鱉fut2基因的表達

Real-time PCR結果顯示，中華鱉fut2在所檢測的各個組織中均有表達。其中，在心臟中表達量最高，在腦組織中表達量最低，在中華鱉腦組織中fut2的表達量顯著低于回腸后段、肝臟、肌肉和心臟；在回腸后段、大腸、肺、脾臟和肝臟中表達量適中（圖 6）。

3 討論

巖藻糖基轉移酶是一類己糖基轉移酶，作為一種關鍵性酶類，在人類疾病發展中起著至關重要的作用。例如，FUT2可能會影響大腸桿菌在腸道的黏附過程[13]，從而影響動物的健康。同時有研究表明，腸道上皮中巖藻糖的缺乏可以改變腸道上皮的通透性，會造成腸道菌群經肝門循環到達肝臟，造成肝臟細菌感染[14]。此外，有眾多研究表明，FUT2與潰瘍性結腸炎和急性腸胃炎關系密切[15-17]。

本研究利用RACE技術，首次獲得了中華鱉fut2基因全長，通過對中華鱉fut2基因進行生物信息學分析發現，中華鱉FUT2蛋白屬于脂溶性蛋白。對蛋白結構和信號肽進行分析后發現，中華鱉FUT2蛋白無信號肽，但存在一個跨膜結構，說明中華鱉FUT2蛋白不是分泌型蛋白，與欽偉云等[18]研究東串豬FUT2的氨基酸序列結果相似。多序列比對后發現，中華鱉fut2基因具有高保守性，系統進化分析顯示，在進化過程中保守性較高，與其他物種的相似性在76%～87%,中華鱉與西部錦龜等爬行動物親緣關系較近，與人和小鼠親緣關系較遠，表明中華鱉的fut2基因符合其進化順序。

研究fut2基因在中華鱉組織中表達分布，有利于更好地了解fut2基因的功能。因此，本研究選擇8只中華鱉分析fut2基因在其組織中的表達水平，結果發現，fut2基因在中華鱉所檢測組織中都進行了表達，表明fut2基因具有廣泛的組織表達特征，在中華鱉的生長過程中可能起著十分重要的作用。研究表明，fut2僅限制性表達在內胚層起源的胃腸上皮和唾液腺[19]，這與fut2在中華鱉各組織中的表達模式相似。

綜上所述，本研究報道了中華鱉fut2基因的分子特征，并對其組織特異性表達進行了相關研究，但由于腸道菌群結構的復雜性，具體fut2基因在中華鱉腸道微生物中的功能和調節機制等仍需進一步地深入研究。

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