腹腔鏡下射頻消融聯合靜脈化療對肝癌患者血清腫瘤標志物甲胎蛋白、細胞角蛋白19、父系表達基因10表達的影響

祁生福

(青海省交通醫院 外一科,青海 西寧,810008)

肝癌是指由于肝細胞或肝內膽管上皮細胞發生的惡性腫瘤，是世界范圍內發病率均較高的惡性腫瘤[1-2]。流行病學研究[3-4]指出，中國是全球范圍內肝癌發病率最高的國家，男性較女性多發，其中男性發病率約為33.7/10萬，女性發病率約為12.3/10萬，其中肝癌死亡率占中國所有惡性腫瘤死亡的18.8%,位居第2位，僅次于胃癌，且其發病率呈逐年升高趨勢。肝癌最常見的臨床表現有肝區疼痛、全身乏力、食欲減退、消瘦以及出現進行性肝臟腫大，其發病原因可能與乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、寄生蟲感染、曲霉毒素的攝入，以及自身的遺傳因素等有關，其具體作用機制目前并未十分明確[5]。針對肝癌的治療，仍是以手術切除為首選方法，研究[6]指出，外科根治手術治療肝癌患者的5年生存率為50%～60%,但其弊端在于術后復發率高，手術切除治療的肝癌患者術后5年復發率高達80%,并不能給患者生命安全帶來保障。隨著微創治療理念逐漸成熟，內窺鏡技術不斷發展，腹腔鏡下射頻消融術(LRFA)在近年來逐漸興起，并應用于臨床治療惡性腫瘤，是一種具有創傷小、恢復快的新型手術方法，且研究[7]指出LRFA較傳統外科根治術相比，并不增加患者死亡率(P<0.05),但關于聯合應用LRFA和靜脈化療對肝癌患者血清腫瘤標志物影響的報道卻較為少見。本研究通過聯合應用LRFA和靜脈化療治療肝癌患者，探討其對肝癌患者血清腫瘤標志物水平的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年8月—2016年10月就診于本院腫瘤科，確診為原發性肝癌的患者86例。其中男47例，女39例，年齡50～75歲，平均年齡(63.51±8.62)歲。將所有患者隨機分為2組，其中實驗組43例，男24例，女19例，年齡平均(62.97±8.73)歲，病程(1.65±0.23)月，腫瘤平均直徑(6.25±0.83) cm; 對照組43例，男23例，女20例，年齡平均(63.85±8.92)歲，病程(1.59±0.21)月，腫瘤平均直徑(6.31±0.79) cm。2組患者的年齡、性別、病程、腫瘤組織大小等一般資料均無顯著差異(P>0.05)。本研究已通過本院倫理委員會批準，且全部患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷及納排標準

診斷標準: 參照中國抗癌協會肝癌專業委員會制定的原發性肝癌診斷標準[8]: ① 臨床表現為肝區持續性疼痛、腹脹、食欲減退、乏力、進行性消瘦，上腹部腫塊等; ② 經肝臟CT、MRI或肝臟動脈造影等影像學檢查確診; ③ 血清AFP≥400 μg/L,時間≥1個月或AFP≥200 μg/L,時間≥2個月，并排除其他原因所致的AFP升高，包括急性肝炎、肝硬化、妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤等。

納入標準: ① 全部患者均符合原發性肝癌的診斷標準; ② 經影像學檢查及病理組織活檢確診; ③ 患者年齡50～75歲; ④ 肝癌未發生遠處轉移; ⑤ 患者及家屬自愿參與本實驗，并簽署知情同意書。

排除標準: ① 不符合原發性肝癌的診斷標準或納入標準者; ② 患者同時伴有其他系統的惡性腫瘤等疾病; ③ 伴有心肺功能障礙不全，無法耐受手術者; ④ 伴有嚴重的腎功能不全或血液系統疾病; ⑤ 患者中途退出治療或放棄治療。

1.3 研究方法

對照組給予常規靜脈化療方案，具體治療方法: 以85 mg/m2在第15天靜脈滴注奧沙利鉑(L-OHP); 在第15、16天前2 h靜脈滴注亞葉酸鈣(LV)200 mg/m2和5-氟尿嘧啶(5-Fu) 400 mg/m2; 在第15、16天以600 mg/m2持續泵入5-Fu,時間持續22 h。

實驗組患者在對照組的治療基礎上聯合應用腹腔鏡下射頻消融術[9]。具體手術方法如下: 囑患者取平臥位，通過彩色多普勒超聲儀(武漢藍潤醫療電子有限公司，型號IE36)對肝臟腫瘤進行定位，然后經常規消毒后鋪無菌洞巾，采用利多卡因進行局部麻醉，在右上腹肋緣下做一弧形切口。采用射頻治療儀(深圳市惠貽華普電子有限公司，型號S-1300)及射頻針，在肝臟腫瘤邊緣進行縫合1圈，依據肝臟腫瘤組織大小步入2～3 根射頻針，覆蓋面包括腫瘤根部。射頻消融參數設置: 輸出功率為150 W、靶溫度為105 ℃。若肝臟腫瘤組織直徑在4.0 cm以內則一次性完成手術治療; 若直徑超過4.0 cm則多次進行腹腔鏡下射頻消融術。待射頻消融結束后再通過彩超查看肝臟腫瘤組織是否完全消融，若不完全則再次進行射頻消融術。拔針后確認無出血、膽汁漏出后結束手術。

1.4 觀察指標

1.4.1 血清腫瘤標記物水平: 治療前、治療后分別收集2組患者的空腹靜脈血，分離血清裝入EP管中，保存于-80℃冰箱中待測。本實驗檢測的腫瘤標志物主要包括甲胎蛋白(AFP)、糖蛋白抗原19 (CA19)及肝癌高表達基因10 (PEG10)。血清中AFP、CA19及PEG 10水平均采用酶聯免疫吸附(ELISA法)進行檢測，試劑盒由北京博奧醫學檢驗所有限公司提供，由本院檢驗中心專業人員嚴格按照說明書進行操作。

1.4.2 腫瘤組織相關基因mRNA表達量: 治療結束后，收集2組患者的肝臟腫瘤組織進行活檢，應用逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測肝臟腫瘤組織的相關基因表達。PTEN 信號通路相關基因主要檢測PTEN、缺氧誘導因子-1(HIF-1)及血管內皮生長因子(VEGF)mRNA 表達量; Wnt信號通路相關基因主要檢測β-鏈蛋白(β-catenin)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、c-myc 和基質金屬蛋白酶7(MMP-7)mRNA 表達量。實驗操作結束后應用軟件分析PCR 過程中的CT 值，將對照組患者相關基因的mRNA 表達量設為100,計算實驗組患者相關基因的mRNA 表達量。

1.4.3 治療后4 個月復發率及生存時間: 患者經治療出院4 個月后復查肝臟CT 如果發現腫瘤原發病灶變大，周圍可發現新的腫瘤病灶，肝臟彩超表明腫瘤內存在血流信號則認為腫瘤局部復發。此外，每月通過電話對患者進行回訪，詢問患者的生存時間及一般身體狀況(如飲食、睡眠、二便等)。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 2組患者治療前后血清腫瘤標記物水平比較

治療后,2組患者的血清腫瘤標志物AFP、CA 19及PEG 10水平均較治療前顯著降低(P<0.05),其中實驗組患者的血清AFP、CA19及PEG10水平下降幅度顯著大于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者治療前后血清腫瘤標記物水平比較

與治療前比較,*P<0.05; 與對照組比較,#P<0.05。

2.2 2組患者治療后腫瘤組織PTEN 通路相關基因表達量比較

治療后，實驗組患者的腫瘤組織PTEN 通路相關基因PTEN mRNA 表達量顯著高于對照組患者,HIF-1及VEGF mRNA 表達量顯著低于對照組患者(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者治療后腫瘤組織PTEN 通路相關基因表達量比較

與對照組比較,*P<0.05。

2.3 2組患者治療后腫瘤組織Wnt 通路相關基因表達量比較

經治療后，實驗組患者的腫瘤組織Wnt 通路相關基因β-catenin、CyclinD1、c-myc 和MMP-7mRNA 表達量均顯著低于對照組患者(P<0.05)。見表3。

2.4 2組患者治療后4 個月復發率及生存時間比較

治療后，實驗組局部復發11例(25.58%),對照組局部復發14例(32.56%),2組局部復發率無顯著性差異(P>0.05)。實驗組中位生存期為28.3個月，與對照組的13.7個月相比顯著延長(P<0.05)。見表4。

表3 2組患者治療后腫瘤組織Wnt 通路相關基因表達量比較

與對照組比較,*P<0.05。

表4 2組患者治療后4 個月復發率及生存時間比較[n(%)]

與對照組比較,*P<0.05。

3 討 論

肝癌是以高發病率和高死亡率為特點的臨床常見惡性腫瘤，預后較差，自然生存期不超過3～6個月，對中國居民生命安全帶來較大威脅，其早期診斷和治療是臨床工作者關注的重點[10-11]。LRFA是現階段用于治療肝癌、直腸癌等中晚期惡性腫瘤的方法之一，文獻[12]報道指出，行LRFA治療直腸癌患者，可明顯降低患者腫瘤局部復發率，說明LRFA不僅可以降低手術創傷，在保證臨床療效的同時降低術后腫瘤復發率。LRFA的作用機制，是在腹腔鏡的引導下，將射頻電極針插入腫瘤組織捏，通過應用400～500 kHz的高頻電流產生的離子震蕩，并轉化為熱能傳導至腫瘤細胞內，將肝癌患者惡變局部的腫瘤細胞加熱至50 ℃以上，促使腫瘤細胞的細胞膜溶解、蛋白質變性等，并最終導致腫瘤細胞裂解死亡[13],但腫瘤周圍的正常組織損傷較小。因此LRFA是一種既能有效殺死腫瘤細胞，又對正常細胞損傷小的惡性腫瘤患者治療手段。因此，本研究通過觀察肝癌患者治療前后血清AFP、CK 19、PEG 10水平變化，以明確LRFA聯合靜脈化療，對肝癌患者血清腫瘤標志物的影響。

血清腫瘤標志物水平的動態監測對惡性腫瘤的早期發現、發展以及預后的評價具有重要意義，是惡性腫瘤患者早期發現、早期治療，以及爭取最長生存率的重要指標檢測[14-18]。AFP已成為診斷原發性肝癌的重要腫瘤標志物，其對肝癌的特異度為76%～91%,敏感度為39%～64%[19-20]。研究[21-24]指出，敲除腫瘤細胞PEG 10基因，能夠起到抑制腫瘤細胞生長、增殖的作用。CK 19分子通過與正常細胞基底膜粘連蛋白聯接，并觸發免疫反應進一步破壞基底膜，以起到促進腫瘤侵襲其他正常細胞，且肝癌中高水平表達的CK19說明肝癌具有更高的惡性程度和侵襲性[25-26]。本研究結果顯示，治療前2組患者血清AFP、PEG 10、CK 19均明顯高于正常水平，說明肝癌患者機體處于高惡性程度和高侵襲性水平，經治療后實驗組患者血清AFP、PEG10、CK 19水平明顯低于對照組，其原因可能與實驗組應用LRFA聯合靜脈化療有關。LRFA應用治療后，實驗組患者大量腫瘤細胞被裂解、殺死，其血清AFP、PEG 10、CK 19水平隨之降低，其具體作用機制尚需從基因學角度進行更深入的研究。

目前大量研究[27-28]表明,PTEN 信號通路在細胞增殖、凋亡過程中扮演著重要的角色，主要調節腫瘤組織的血管生成。PTEN 屬于抑癌基因，其發生突變及表達含量降低都會導致腫瘤的發生發展[29]。HIF-1 和VEGF 是PTEN 信號通路的下游基因，當PTEN 信號通路被激活后,HIF-1 和VEGF 基因呈現高表達，共同調節VEGF表達和血管內皮生長因子受體(VEGFR)轉錄，從而促進腫瘤血管生成。本實驗結果顯示，治療后實驗組患者的腫瘤組織PTEN 通路相關基因PTEN mRNA 表達量顯著高于對照組患者(P<0.05),HIF-1及VEGF mRNA 表達量顯著低于對照組患者(P<0.05),由此可見腹腔鏡下射頻消融聯合靜脈化療能夠促進PTEN基因表達，抑制HIF-1 和VEGF基因表達，從而減少腫瘤血管新生。Wnt 信號通路在多種惡性腫瘤的發生發展過程中發揮了重要的作用。近年來有關肝癌的研究[30]顯示，Wnt 信號通路及其下游基因在肝細胞癌變的發生發展過程中具有重要的促進作用。β-catenin、CyclinD 1、c-myc和MMP-7是目前較為公認的Wnt 信號通路下游分子，主要影響腫瘤細胞的生長。本實驗結果顯示，治療后實驗組患者的腫瘤組織Wnt 通路相關基因β-catenin、CyclinD 1、c-myc 和MMP-7mRNA 表達量均顯著低于對照組患者(P<0.05)。由此可見，腹腔鏡下射頻消融聯合靜脈化療能夠抑制Wnt 信號通路，組織腫瘤生長。

本研究通過對比分析86例原發性肝癌患者治療前后的血清腫瘤標志物AFP、CK 19、PEG 10水平、腫瘤組織相關基因mRNA表達量以及治療后4 個月復發率及生存時間，證實了腹腔鏡下射頻消融聯合靜脈化療能有效降低肝癌患者血清腫瘤標志物AFP、CK 19、PEG 10水平，通過PTEN 通路、Wnt 通路抑制肝癌細胞生長，延長生存時間。

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