抗凍酵母的篩選及發酵特性研究

薛美翠汪立平, 郝彥利 王正全 趙 勇 黃宇良

(1. 上海海洋大學食品學院食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306；2. 上海洋大學食品學院上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306)

普通商業酵母在低溫條件下易受冷凍迫害且解凍后不能保留應有的發酵力，從而影響發酵面制食品的風味和口感，因此不能應用于冷凍面團的制作。采用耐凍性能好的酵母制作冷凍面團是制約冷凍面團技術的一個關鍵因素[1]。

目前，國外報道的抗凍酵母戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)[2]、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FRI-413[3]和FRI-802[4]、耐熱克魯維酵母(Kluyveromycesthermotoleras)FRI-501[5]，均是通過自然篩選方式得到的，并且已經應用到實際面包生產行業當中。中國也有研究者[6-7]通過自然篩選的方法得到抗凍酵母，但是沒有應用到實際工業生產中的報道。此外，近幾年由于分子技術的發展，很多研究者開始從影響酵母抗凍機理方面進行研究，采用分子育種方法得到抗凍酵母。已有報道表明，細胞內的幾種化合物含量影響細胞對凍融壓力的耐受性，這些化合物包括海藻糖[8-9]、甘油[10]、脯氨酸[11]及精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等帶電荷氨基酸[12]。Sun等[8]通過表達MAL62基因增加胞內海藻糖含量，進而提高細胞的抗凍能力；Dong等[9]通過敲除基因NTH1增加胞內海藻糖含量，進而提高細胞的抗凍能力。甘油脫氫酶(GDH)主要參與甘油的代謝過程，Izawa等[10]將GDH基因敲除，從而增加胞內甘油含量，使細胞存活率增大。Takagi等[12]發現其他帶電荷氨基酸包括谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸和脯氨酸的抗冷凍能力等同于海藻糖和甘油，都被認為是酵母細胞的冷凍保護劑。Tsolmonbaatar等[11]將PRO1基因突變，從而使菌株胞內脯氨酸含量增加，進而增加細胞的抗凍作用；精氨酸酶由CAR1基因編碼，Shima等[13]通過敲除CAR1基因，證實了胞內精氨酸含量的積累會增加細胞的抗凍性。為了提高細胞的存活率，研究者提出了其他的方法與技術，包括添加劑的應用，例如抗凍蛋白[14](antifreeze proteins, AFPs)、親水膠體[15]；改善冷凍工藝，例如James等[16]提出，緩慢的冷凍速率會形成對組織細胞造成迫害的大冰晶，而過快的冷凍速率同樣也會對細胞存活率有消極的影響，因此，在應用冷凍面團技術時，應該根據不同生產工藝選擇合適的冷凍速率，從而保證細胞的存活率[17-18]；為了控制面團在冷凍期間形成的冰晶對酵母細胞的影響，超聲波輔助冷凍(UAF)也被應用到冷凍食品行業[19]，Kiani等[20]的研究表明，在-4～-2 ℃ 時使用超生波輔助冷凍可能增加細胞的存活率，但是，該技術在冷凍面團行業的應用非常局限，相關報道較少。

本研究擬從自然界篩選抗凍性好且冷凍后發酵力高的野生耐冷凍酵母菌。采用模擬面團預發酵法篩選耐冷凍酵母，分析胞內化合物與細胞存活率、相對發酵力的相關性，考察胞內化合物對存活率和相對發酵力的影響，總結出提高自然篩選法效率的方法，對冷凍面團技術應用到中國傳統主食的生產具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

傳統發酵酸面團：來自東北、山東、河南、內蒙古省的4個農村地區；

市售發酵劑面包酵母：上海市農工商超市，編號A-1，作為整個試驗過程的對照組；

DP307酵母菌DNA提取試劑盒：天根生物技術公司；

26S rDNA通用引物：上海生工生物技術公司；

海藻糖：標準品，上海金穗生物科技有限公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

YPD培養基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，pH 6.0，溶解于1 L蒸餾水，用于酵母菌的初篩；

平板計數培養基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂粉20 g，pH 5.5，溶解于1 L蒸餾水，用于冷凍后酵母菌菌落計數，計算存活率。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV2000型，上海尤尼柯有限公司；

冷凍離心機：H2050R型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫療器械廠；

酸度計：pHS-3C型，上海虹益儀器廠；

PCR儀：H1650-W 型，杭州朗基科學儀器有限公司；

水平電泳儀：PYY-6C型，北京六一儀器廠；

凝膠成像儀：EC3 Imaging System型，美國UVP公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8800型，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 在無菌條件下，分別從4個樣品中取10 g面團加入90 mL生理鹽水(85%)中，無菌均質5 min(12次/s)，梯度稀釋至10-7，各梯度取100 μL涂布于YPD平板培養基上，30 ℃培養48 h，待平板長出菌落，將符合酵母菌細胞形態的菌落至YPD平板培養基多次劃線，直至完全純化。將市售發酵劑面包酵母溶解于生理鹽水后，直接用于平板劃線。將純化后的酵母菌種轉接到YPD斜面培養基上，28 ℃培養2～4 d后，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 鮮酵母的制備 將酵母菌種從YPD斜面培養基轉接入內裝200 mL YPD 培養基的三角瓶中，30 ℃、150 r/min 培養24 h，發酵液于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，蒸餾水洗滌2次，得到各菌株的鮮酵母泥。在105 ℃將鮮酵母烘干，測定鮮酵母烘干前后的質量，計算含水率。

1.2.3 抗凍性試驗 根據文獻[6]修改如下：稱取0.4 g鮮酵母加入裝有50 mL模擬面團培養基的三角瓶中(模擬面團培養基的配置參照文獻[21])，30 ℃預發酵180 min后進行菌落計數。存活率定義為冷凍7 d后和冷凍1 h后酵母菌菌落數的百分比。抗凍性試驗重復6次。

1.2.4 酵母胞內化合物含量測定

(1) 海藻糖含量測定：采用硫酸-蒽酮法[22]。酵母菌細胞內的海藻糖用三氯乙酸提取，所得溶液僅有海藻糖存在[23]。胞內海藻糖含量Wt(%，細胞干重)計算公式參考文獻[24]42。

(2) 甘油含量的測定：采用比色法測定[25]。胞內甘油含量Wt(%，細胞干重)計算公式參考文獻[24]43。

(3) 胞內氨基酸含量的測定：采用氨基酸分析儀測定[26]。以上所有酵母胞內化合物重復測定次數為3次。

(4) 胞內甘油和氨基酸的提?。簠⒄瘴墨I[27]。

1.2.5 酵母菌發酵力的測定 采用失重法[28]。用于發酵的營養液配比參照文獻[29]，準確稱取2.5 g鮮酵母加入裝有50 mL營養液的三角瓶中，將酵母菌和發酵液混合均勻，蓋上發酵栓稱重后置于30 ℃恒溫培養箱預發酵1 h。冷凍操作同1.2.3，將解凍后的發酵液放置恒溫培養箱中，記錄2 h 的產氣情況。通過冷凍7 d產氣量的變化來判斷酵母菌的發酵能力。相對發酵力定義為冷凍7 d后和冷凍1 h后CO2產氣量的比值。發酵力重復測定3次。

1.2.6 數據分析處理 采用Origin 8.6進行數據處理和繪制圖表；采用SPSS 20.0軟件分析細胞存活率和酵母菌發酵力與胞內化合物(海藻糖、甘油、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及總氨基酸)含量的相關性，單因素方差分析以P<0.05 為具有統計學意義。

1.2.7 菌種鑒定 根據菌株菌落形態進行初步鑒定[30]，再通過26S rDNA 序列分析法鑒定酵母，對測序的結果在NCBI網站進行核苷酸序列Blast比對分析，并用MEGA 5構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 抗凍酵母的篩選

2.1.1 酵母菌的篩選 從4個酸面團中篩選得到具有典型酵母菌菌落特征的菌株共7株。對菌株進行編號，其中從內蒙古面團中分離得到一株，編號N-1；河北面團中分離得到一株，編號H-1；山東面團中分離得3株，編號S-1、S-2、S-3；東北面團中分離得到2株，編號Y-3和Y-4。

2.1.2 抗凍酵母菌的篩選 按照1.2.3所示的方法，分別對7株酵母菌在模擬面團中預發酵3 h，測定冷凍7 d 和1 h 后的存活率，結果見圖1。從圖1中可以看出，菌株Y-3和Y-4在模擬面團中預發酵3 h，冷凍7 d后存活率分別是86%和94%，存活率均高于已被報道的抗凍酵母菌的存活率[2,6]。其他菌株的存活率均在70%以下，對照組A-1菌株的存活率不到10%，說明對照組酵母菌對低溫特別敏感，不適于冷凍面團的制作。

2.2 數據分析

2.2.1 抗凍酵母胞內海藻糖含量 海藻糖標準曲線的回歸方程為：y=6.671 4x-0.018 2，R2=0.997 0，用于海藻糖濃度的計算。酵母胞內海藻糖含量見圖2。從圖2中可以得知，存活率最高的菌株Y-4其海藻糖含量最高為10.91%，而存活率次之的菌株Y-3，其海藻糖含量卻低于存活率不到70%的菌株S-1、S-2和N-1，經方差分析得菌株Y-3與菌株S-1和N-1的海藻糖含量均不具有顯著性差異(P>0.05)，菌株Y-3與菌株S-2的海藻糖含量具有顯著性差異(P<0.05)。說明海藻糖對細胞存活率有一定的影響，但不是唯一決定細胞存活率的因素，與Hino等[31]報道的抗凍菌株FRI 501情況相同。

圖1 酵母菌在-20 ℃的存活率

圖2 酵母菌胞內海藻糖含量

2.2.2 抗凍酵母胞內甘油含量 甘油標準曲線的回歸方程為：y=21.469x+0.001，R2=0.996 0，可用于甘油濃度的計算。從圖3中可以得知，菌株Y-3和Y-4的甘油含量遠遠高于其他抗凍性差的菌株的，通過單因素方差分析可知，甘油含量對細胞存活率的影響具有顯著性差異(P<0.05)。說明細胞內甘油含量的積累對細胞存活率有影響，與已報道[10,32]的通過分子技術積累甘油的酵母細胞具有較高的抗凍性結果相同。

圖3 酵母胞內甘油含量

2.2.3 抗凍酵母胞內氨基酸含量 已有研究[11-12]表明脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸4種氨基酸均與細胞抗凍性有關，因此，本研究只對這4種氨基酸進行分析。酵母菌胞內氨基酸含量測定結果見表1。從表1中可以看出，不同酵母菌氨基酸含量差異較大，通過單因素方差分析可知，4種氨基酸對細胞存活率均有顯著性影響(P<0.05)。菌株Y-4的存活率最高，但是其4種氨基酸的含量均低于存活率僅為31%的菌株S-3，且通過方差分析得知，菌株Y-4與S-3的脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸均具有顯著性差異(P<0.05)；此外，除了酵母中沒有檢出脯氨酸，菌株H-1的天冬氨酸含量低于菌株Y-3，其他菌株的氨基酸含量均高于菌株Y-3的，且菌株Y-3與H-1的脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸均具有顯著性差異(P<0.05)，與已報道[5,12,33]的細胞內某些帶電荷氨基酸會影響到細胞耐冷凍率，但不是主要影響因素的結論一致。

表1 酵母菌胞內氨基酸含量 Table 1 Intracellular amino acids level of yeasts mg/g

2.2.4 不同酵母相對發酵力的測定結果 從圖4中可以看出，冷凍1 h后菌株Y-3和N-1的發酵力低于對照組酵母A-1，并具有顯著性差異(P<0.05)；冷凍7 d 對對照組酵母A-1和菌株Y-3的發酵力影響最大，但不具有顯著性差異(P>0.05)，其他菌株的發酵力與對照組酵母的發酵力均具有顯著性差異(P<0.05)。

對照組酵母A-1和菌株Y-3的相對發酵力均為9%，菌株H-1的相對發酵力最高為67%，是對照組酵母發酵力的7倍之多，具有應用到生產冷凍面團的潛在價值。

圖4 不同酵母的發酵力

2.2.5 胞內化合物對細胞存活率及發酵力相關性 由表2可知，酵母胞內海藻糖含量與細胞存活率呈顯著正相關，與相對發酵力呈負相關，與Sun等[8]和Tan等[34]報道的胞內海藻糖含量的提高可以顯著提高細胞存活率，且胞內海藻糖含量與發酵力不存在相關性的結論一致；甘油與存活率具有顯著相關性，與相對發酵力呈負相關，與Izawa等[10]通過基因敲出方法使胞內甘油含量增大，從而提高細胞存活率和發酵力的結論一致，而與Myers等[35]通過在面團中添加外援甘油，從而提高細胞的發酵力結果不一致，可能是試驗方法不一致造成的；脯氨酸含量與細胞存活率呈正相關，而與相對發酵力呈負相關，與Sasano等[36]報道的增加脯氨酸含量可以相應地增加細胞存活率和發酵力的觀點不一致，可能是表達MPR基因減少活性氧(ROS)水平，從而改善細胞存活率和發酵力；精氨酸含量與細胞存活率、發酵力均為負相關性，與Shima等[13]報道的通過敲除精氨酸氧化酶基因，增加細胞胞內精氨酸含量，從而增加細胞存活率和發酵力的報道不一致，可能是經過基因敲出等分子育種方法改變了精氨酸的代謝機制造成；天冬氨酸和谷氨酸含量均與細胞存活率呈負相關，且與細胞發酵力呈顯著正相關，與Takagi等[33]報道的細胞內某些帶電荷氨基酸會影響到細胞耐冷凍率，但不是主要影響因素的結論一致。

2.3 菌種鑒定

通過冷凍7 d后測定細胞存活率和相對發酵力的結果可知，菌株Y-3、Y-4的存活率最高，菌株H-1的相對發酵力最高，因此，對這3株菌株進行菌落形態和分子生物學鑒定。

2.3.1 菌落形態鑒定 各菌株的菌落形態見圖5。菌株Y-3菌落顏色為白色，菌落較小，形態為圓形，表面光滑、濕潤、黏稠、容易挑起；菌株Y-4菌落顏色為白色，菌落較小，形態扁平，不光滑，不透明，不易挑起；菌株H-1菌落顏色為乳白色，菌落較大，菌落中央凸起，光滑，不透明，容易挑起，有明顯的酒香味。

圖5 不同菌株的菌落形態

項目細胞存活率相對發酵力海藻糖甘油脯氨酸精氨酸天冬氨酸谷氨酸細胞存活率1.000相對發酵力-0.3001.000海藻糖 0.706?-0.2401.000甘油 0.777?-0.3080.776?1.000脯氨酸 0.134-0.513-0.0850.2331.000精氨酸 -0.448-0.546-0.200-0.2730.5461.000天冬氨酸 -0.6830.745?-0.586-0.5710.588-0.1031.000谷氨酸 -0.6970.766?-0.693-0.6210.550-0.1330.983?1.000

? *表示在0.05水平相關顯著。

2.3.2 分子生物學鑒定 圖6是菌株Y-3、Y-4和H-1的26S rDNA 基因擴增電泳圖，從圖6中可以看出，3株菌核苷酸序列均在600 bp左右出現特異性亮帶。PCR產物測序結果在NCBI網站上進行核苷酸序列Blast比對結果表明，Y-3與漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)的相似性為100%，Y-4與贊斯托假絲酵母(Candidaxestobii)的相似性為99%，H-1與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的相似性為100%。查閱相關文獻[37]，假絲酵母菌屬于條件致病菌，會引起病人尿道感染。漢遜酵母屬于生香酵母，石嬌嬌等[38]從自然發酵的甜面醬中也篩選到該菌株并且對其發酵產物進行檢測，說明該菌株在食品方面的應用已經有一定的理論基礎，應用價值較大。因此，選擇Y-3和H-1作為后續研究菌株。

2株菌的系統發育樹見圖7、8。菌株Y-3與菌株DebaryomyceshanseniiKY512216.1在同一分支上，同源性為92%；菌株H-1與菌株SaccharomycescerevisiaeLC336458.1在同一分支上，同源性為99%，因此，可以確定菌株Y-3為Debaryomyceshansenii，菌株H-1為Saccharomycescerevisiae。

3 結論

本研究通過模擬面團預發酵法和測定酵母胞內化合物2種方法相結合，篩選得到抗凍酵母菌Y-3(Debaryomyceshansenii)，且不同于已報道的耐冷凍酵母[2-5]；與分子育種相比較[8-10]，自然篩選得到的野生酵母可以保留原有發酵食品的風味口感，食用安全性可以得到保證，從而體現出本試驗所篩選到的酵母的優勢；本試驗對海藻糖、甘油、氨基酸含量與細胞存活率和發酵力的相關性進行分析，發現海藻糖和甘油的含量與細胞存活率呈顯著正相關，因此，后續研究若采用自然篩選法篩選耐冷凍酵母時，可以先測定胞內海藻糖和甘油的含量，縮小抗凍性試驗的篩選范圍，從而降低工作量，增大篩選效率。

圖7 菌株Y-3的26S rDNA系統發育樹

圖8 菌株H-1的26S rDNA系統發育樹

由于冷凍面團技術中的酵母菌在冷凍解凍后必須仍就保持較高的存活率和發酵力，因此，試驗后期會對存活率高的菌株Y-3和發酵能力好的菌株H-1進行混合發酵，得到最優酵母添加比例，以期應用到冷凍面團的制作中。

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