南疆傳統發酵酸奶中酵母菌的分子鑒定及抗氧化活性研究

古麗娜孜·卡哈爾 努爾古麗·熱合曼 迪麗拜爾·玉山 麥克麗亞·亞力昆

(新疆師范大學，新疆 烏魯木齊 830054)

新疆地域遼闊，氣候多樣，向來就以其豐富的乳制品資源著稱。當地的傳統發酵酸奶更是歷史悠久，味道可口[1]。傳統發酵食品的微生物區系通常有細菌與酵母菌組成，少數情況下也有霉菌參與。這些微生物在發酵過程中，增添了獨特的芳香物質與層次感[2]。酵母菌在真核微生物群體當中所占的數量龐大，分布廣泛，而且在生物技術方面擁有多種用途[3-4]。在眾多發酵食品當中酵母菌占有舉足輕重的地位[5]。此外，酵母菌可以從外界環境中吸取酚類物質，具有提高自身抗氧化活性的能力[6]，含有豐富的維他命B6、B12以及可以與各種酶類有協同作用的諸多礦物質[7]。傳統工業化生產的酸奶主要發酵菌是乳酸菌，很少會將酵母菌添加為發酵菌，酵母菌一直以來也被看做是引起產品腐壞的腐敗菌。

在鑒定方面，隨著科學技術水平的發展，26S rDNA及其轉錄間區 ITS 的序列分析等技術被越來越多地應用于酵母菌的分類與序列分析當中[8-9]。Kurtzman等[10]對大約500種子囊菌酵母和擔子菌酵母26S rDNA 中的D1/D2區域序列進行了研究，發現該方法可以將絕大部分分離開來。由于這些序列均已公布于GenBank/EM-BL/DDBJ等國際核酸數據庫，為酵母菌的分子分類學、分子系統學和多樣性的研究帶來很大便利[11] 8-9。近年來，Lachance等[12]發現Clavisporalusitaniae的26S rDNAD1/D2區具有顯著的多態性。隨著研究的深入，發現愈來愈多的酵母菌中存在個體基因組ITS和26S rDNA序列多態性，同一菌株基因組內不同類型的ITS序列差異也可能遠遠超過菌種間的差異范圍[13]。因此，僅僅依靠單一序列的鑒定結果會有一定程度的不確定性。在抗氧化活性方面，中國已有利用抗氧化活性酵母在小鼠體內進行抗衰試驗等方面的研究[14]。

本研究擬以新疆阿圖什與烏什的4種酸奶中分離純化得到的78株酵母菌為研究對象，采用26S rDNA D1/D2區域及ITS內轉錄序列擴增技術進行分子生物學鑒定，并對其總抗氧化能力，羥基自由基抑制能力、抗超氧陰離子自由基能力以及脂質過氧化物產量進行測定，篩選出具有優良抗氧化活性的菌株；通過雙序列測序技術對分離得到的酵母菌進行鑒定，使用MEGA 7.0等生物學軟件繪制系統發育進化樹，并對南疆地區酸奶中的酵母菌抗氧化活性進行初篩，為酵母菌資源的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及其來源

傳統手工酸奶：阿圖什與烏什地區農民家庭作坊生產，將樣品裝置于無菌容器，運至實驗室后置于4 ℃保藏，從中分離純化得到78株酵母菌，標號，并用20%甘油于-80 ℃超低溫冰箱保種。

1.1.2 儀器與試劑

立式壓力蒸汽滅菌器：LZDZX-30KBS型，上海申安醫療器械廠；

離心機：BLF6型，上海一恒科技有限公司；

PCR儀：LNB48+型，上海皓莊儀器有限公司；

分光光度計：722型，上海菁華科技儀器有限公司；

酵母浸粉、蛋白胨：分析純，北京澳博星生物技術有限責任公司；

葡萄糖、瓊脂：分析純，合肥志宏生物技術有限公司；

酵母菌基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；

上游引物(NL1、ITS1)、下游引物(NL4、ITS4)：上海生物工程股份有限公司；

總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(貨號A015-1)、脂質過氧化(LPO)測試盒(貨號A106)、抗超氧陰離子自由基測試盒(貨號A052)、羥基自由基測定試劑盒(貨號A018)：南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

(1) 菌種活化：在提取酵母菌基因組DNA之前先對其進行2次活化，將用甘油凍藏(-80 ℃)的酵母菌菌株按照1%的接種量接種于新鮮配置的YPD培養基中(10 g/L 酵母浸粉, 20 g/L蛋白胨，20 g/L 葡萄糖)[15]，28 ℃培養24 h。

(2) 總DNA的提取：DNA的提取按照試劑盒說明書進行操作，第二步略有改動，水浴時間改為40 min對酵母菌進行破壁處理[16]。

(3) 基因組DNA電泳：提取的DNA采用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓80 V，時長40 min，在凝膠成像儀中觀察凝膠。

(4) 26S rDNA D1/D2區PCR擴增：酵母菌PCR擴增體系見表1，引物為通用引物,正向引物NL1：(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)，反向引物NL4：(5’-GGTCCGTGTTTCA AGACGG-3’)。

表1 26S rDNA D1/D2區 PCR擴增體系[18]

擴增循環為95 ℃ 5 min，預變性，94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，36個循環，72 ℃延伸8 min[17]。擴增結束后取4 μL PCR擴增產物與Golden viewer核酸染料混合點樣，用(1×TAE)緩沖液制備2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，擴增成功在600 bp左右形成可見條帶。PCR產物被送到新疆昆泰銳生物技術有限公司進行測序。

(5) ITS序列PCR擴增：ITS PCR擴增體系見表2，引物采用ITS通用擴增引物，正向引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，反向引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。

表2 ITS PCR擴增體系[18]16

擴增循環為95 ℃ 5 min預變性，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min，30個循環，72 ℃延伸10 min[18]15-16。擴增結束后取4 μL PCR擴增產物與Golden viewer核酸染料混合點樣，用(1×TAE)緩沖液制備2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，擴增成功在400～700 bp左右形成可見條帶[19]。PCR產物被送到新疆昆泰銳生物技術有限公司進行測序。

(6) 同源性分析：利用MEGA7.0 軟件，對被測酵母菌的26S rDNA D1/D2區域、ITS序列以及GenBank中比對獲得的參比菌株序列進行同源性分析，申請菌株登錄號，構建系統發育進化樹。

1.2.2 酵母菌抗氧化活性檢測

(1) 酵母菌細胞的收集：將-80 ℃下甘油保藏的菌株進行活化，將活化好的酵母菌10 000 r/min離心10 min收集細胞。

(2) 酵母細胞預處理：將離心收集的細胞用無菌水洗滌3～5次后進行冷凍干燥(-48 ℃，4 Pa)，凍干細胞備用。利用反復凍融超聲破碎法[20]提取粗酶液。

(3) 抗氧化能力檢測：菌株總抗氧化能力(T-AOC)檢測[21]、羥基自由基抑制能力檢測、抗超氧陰離子自由基能力測試以及產生脂質過氧化物(LPO)含量測試均以南京建成測定試劑盒步驟進行，每個樣品均重復3次。

2 結果與分析

2.1 26S rDNA序列分析結果

分別采用78株菌的基因組序列為模板，采用引物NL1、NL4擴增出26S rDNA D1/D2序列，利用2.0%濃度的瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳，大小約為600 bp(圖1)。擴增序列片段經測序后，通過BIOEDIT生物軟件整理數據并在GenBank 中進行BLAST同源序列搜索，對同源性高的相似菌株序列進行下載。結果表明，78株酵母菌的26S rDNAD1/D2區域基因序列同源性均≥99%，菌株登錄號及名稱見表3。

圖1 部分菌株26S rDNA D1/D2區域序列電泳圖

隨后利用MEGA7.0對序列繪制系統發育進化樹(圖2)。結果表明，阿圖什與烏什縣傳統發酵乳當中的酵母菌共屬于3個屬3個種，其中3個屬分別為酵母屬(Saccharomycescerevisiae)、克魯維酵母屬(Kluyveromycesmarxianus)、畢赤酵母屬(Pichiakudriavzevii)；3個種為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

2.2 ITS序列分析結果

同樣采用78株酵母菌基因序列為模板，利用ITS1與ITS4引物對ITS序列進行擴增，將產物用濃度2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，發現在400～700 bp處出現條帶(圖3)，對擴增產物進行測序后，通過BIOEDIT生物軟件整理數據并在GenBank 中進行BLAST同源序列搜索，對同源性高的相似菌株序列進行下載。結果表明，78株酵母菌的ITS區域基因序列同源性均≥98%，與26S rDNA結果一致，菌株相似性比較結果見表4。

同樣利用MEGA7.0軟件繪制菌株系統發育進化樹(圖4)，結果表明，78株菌分屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。其中NG-98、NG-M66、NG-Y36 3株酵母菌ITS序列相似性只有98%，需通過TA克隆進行進一步研究。

表3 菌株名稱及登錄號

2.3 抗氧化能力篩選

2.3.1 總抗氧化能力(T-AOC) 本試驗通過總抗氧化能力試劑盒，最終測定出78株菌株中42株具有抗氧化活性，見圖5。

通過圖5可以看出，42株酵母中NG-Y50號菌抗氧化活性最高，為(107.33±2.97) U/mL；NG-L18號菌株抗氧化活性最低，僅為(4.29±2.84)U/mL。高于平均值的菌株有NG-40、NG-41、NG-54、NG-56、NG-57、NG-58、NG-87、NG-105、NG-L1、NG-Y50、NG-M60、NG-M66。

圖3 部分菌株ITS序列PCR產物電泳圖

分離菌株登錄號相似菌株分離菌株登錄號相似菌株NG-4KY888043Kluyveromyces marxianusNG-89KY888082Kluyveromyces marxianusNG-12KY888044Kluyveromyces marxianusNG-92KY888083Kluyveromyces marxianusNG-15KY888045Pichia kudriavzeviiNG-93KY888084Saccharomyces cerevisiaeNG-16KY888046Saccharomyces cerevisiaeNG-94KY888085Pichia kudriavzeviNG-21KY888047Saccharomyces cerevisiaeNG-95KY888086Kluyveromyces marxianusNG-30KY888048Kluyveromyces marxianusNG-97KY888087Saccharomyces cerevisiaeNG-31KY888049Kluyveromyces marxianusNG-98KY888088Pichia kudriavzeviiNG-33KY888050Saccharomyces cerevisiaeNG-99KY888089Kluyveromyces marxianusNG-36KY888051Kluyveromyces marxianusNG-100KY888090Kluyveromyces marxianusNG-38KY888052Kluyveromyces marxianusNG-101KY888091Kluyveromyces marxianusNG-39KY888053Kluyveromyces marxianusNG-102KY888092Saccharomyces cerevisiaeNG-40KY888054Kluyveromyces marxianusNG-103KY888093Saccharomyces cerevisiaeNG-41KY888055Kluyveromyces marxianusNG-104KY888094Kluyveromyces marxianusNG-42KY888056Kluyveromyces marxianusNG-105KY888095Saccharomyces cerevisiaeNG-43KY888057Kluyveromyces marxianusNG-106KY888096Kluyveromyces marxianusNG-44KY888058Kluyveromyces marxianusNG-136KY888097Kluyveromyces marxianusNG-45KY888059Kluyveromyces marxianusNG-L1KY888098Saccharomyces cerevisiaeNG-47KY888060Saccharomyces cerevisiaeNG-L8KY888099Saccharomyces cerevisiaeNG-48KY888061Kluyveromyces marxianusNG-L9KY888100Saccharomyces cerevisiaeNG-51KY888062Kluyveromyces marxianusNG-L13KY888101Saccharomyces cerevisiaeNG-53KY888063Kluyveromyces marxianusNG-L14KY888102Saccharomyces cerevisiaeNG-54KY888064Saccharomyces cerevisiaeNG-L17KY888103Saccharomyces cerevisiaeNG-56KY888065Kluyveromyces marxianusNG-L18KY888104Saccharomyces cerevisiaeNG-57KY888066Saccharomyces cerevisiaeNG-L27KY888105Saccharomyces cerevisiaeNG-58KY888067Kluyveromyces marxianusNG-L28KY888106Saccharomyces cerevisiaeNG-61KY888068Kluyveromyces marxianusNG-L29KY888107Saccharomyces cerevisiaeNG-69KY888069Kluyveromyces marxianusNG-M51KY888108Saccharomyces cerevisiaeNG-72KY888070Saccharomyces cerevisiaeNG-M60KY888109Saccharomyces cerevisiaeNG-78KY888071Kluyveromyces marxianusNG-M61KY888110Saccharomyces cerevisiaeNG-79KY888072Pichia kudriavzeviiNG-M66KY888111Saccharomyces cerevisiaeNG-80KY888073Kluyveromyces marxianusNG-Y31KY888112Saccharomyces cerevisiaeNG-81KY888074Saccharomyces cerevisiaeNG-Y33KY888113Saccharomyces cerevisiaeNG-82KY888075Kluyveromyces marxianusNG-Y34KY888114Saccharomyces cerevisiaeNG-83KY888076Kluyveromyces marxianusNG-Y35KY888115Saccharomyces cerevisiaeNG-84KY888077Kluyveromyces marxianusNG-Y36KY888116Saccharomyces cerevisiaeNG-85KY888078Saccharomyces cerevisiaeNG-Y38KY888117Saccharomyces cerevisiaeNG-86KY888079Kluyveromyces marxianusNG-Y39KY888118Saccharomyces cerevisiaeNG-87KY888080Kluyveromyces marxianusNG-Y45KY888119Saccharomyces cerevisiaeNG-88KY888081Saccharomyces cerevisiaeNG-Y50KY888120Saccharomyces cerevisiae

2.3.2 羥基自由基抑制能力 通過羥基自由基測定試劑盒對具有抗氧化活性的42株酵母菌進行測定，結果見圖6。

由圖6可知，在測試的這42株菌株中NG-M61號菌株抑制羥基自由基能力最高，為(755.80±3.63) U/mL；NG-M60號菌株抑制羥基自由基能力最低，僅為(60.46±4.66) U/mL。其中抑制羥自由基能力高于平均值的菌株有NG-15、NG-30、NG-33、NG-40、NG-41、NG-45、NG-53、NG-57、NG-58、NG-72、NG-84、NG-92、NG-93、NG-105、NG-106、NG-L1、NG-L13、NG-Y39、NG-Y50、NG-M51、NG-M61。對篩選抗氧化能力以及抑制羥基自由基能力均高于平均值的7株酵母菌進行抗超氧陰離子自由基測定以及脂質過氧化物(LPO)含量測試。

圖4 部分菌株ITS序列系統發育進化樹

圖5 具有抗氧化活性的菌株及其抗氧化能力

圖6 42株酵母菌羥基自由基抑制能力

2.3.3 抗超氧陰離子自由基能力 抗超氧陰離子自由基能力見圖7。

由圖7可以看出，7株酵母菌中NG-105號菌株的抗超氧陰離子自由基能力最強[(134.29±1.72) U/mL]，NG-58號菌株最弱[(35.53±4.66) U/mL]。

2.3.4 脂質過氧化物含量 脂質過氧化物含量測定結果見圖8。

由圖8可知，本研究所測試的7株酵母菌，產生脂質過氧化物的含量偏低，脂質過氧化物含量最高的菌株NG-Y57所產生的LPO值也僅為(4.97±0.11) μmol/L，而含量最低的菌株NG-105產生的LPO值只有(0.32±0.14) μmol/L。

由表5可以看出，NG-Y50號菌株抗氧化活性最高，抑制羥基自由基能力為(648.73±4.81) U/L，但是其抗超氧陰離子能力[(40.36±4.56) U/mL]不及NG-40，而且NG-40號菌株抗氧化活性為(106.41±3.92) U/mL，抑制羥基自由基能力為(651.24±3.75) U/L，抗超氧陰離子能力為(104.11±3.25) U/mL，而其所含有的脂質過氧化物含量僅有(1.99±0.65) μmol/L。綜上所述，NG-40具有較強的抑制自由基能力，可被開發為新型抗氧化活劑。這株菌被鑒定為馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。

圖7 抗超氧陰離子自由基能力

3 結論

(1) 本研究對酸奶中的酵母菌進行分子鑒定，結果表明，38株屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，36株屬于馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，4株屬于畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。Gabriela Diosma等[22]對開菲爾樣品中分離出的酵母菌進行鑒定，發現它們屬于Saccharomycescerevisiae，Saccharomycesunisporus，Issatchenkiaoccidentalis，Kluyveromycesmarxianus4種酵母。但本試驗的樣品中并沒有發現Saccharomycesunisporus以及Issatchenkiaoccidentalis等酵母菌種，這與樣品的地域性以及種類有關。 Yang等[23]以西藏牦牛酸奶為對象，對其中的酵母菌進行研究，發現它們同樣屬于釀酒酵母，馬克思克魯維酵母與畢赤酵母。李靜等[24]對新疆酸駝乳進行研究時也同樣分離出這3種酵母。由此可見馬克思克魯維酵母與釀酒酵母在傳統發酵乳制品中很常見。

圖8 菌株脂質過氧化物(LPO)含量測定

菌株號總抗氧化活性/(U?mL-1)抑制羥基自由基能力/(U?L-1)抗超氧陰離子自由基能力/(U?mL-1)脂質過氧化物含量/(μmol?L-1)NG-40106.41±3.92651.24±3.75104.11±3.251.99±0.65NG-4157.41±0.98731.86±1.2795.00±1.873.20±0.80NG-5792.61±3.74628.57±4.9858.93±3.444.97±0.11NG-5880.19±2.57704.16±3.8835.53±4.661.49±0.56NG-10590.47±4.35561.78±4.65134.29±1.720.32±0.14NG-L137.57±4.09745.72±4.00117.14±4.631.84±0.91NG-Y50107.33±2.97648.73±4.8140.36±4.562.08±0.31

(2) 通過抗氧化活性試劑盒從78株酵母中篩選出7株高抗氧活性酵母，其中NG-40、NG-41、NG-58為馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，NG-57、NG-105、NG-L1、NG-Y50為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。戴玥等[25]通過超氧陰離子清除率等試驗選出具有高抗氧能力的假絲酵母Y1，其羥基自由基清除能力超過40%。韋琰琰[26]從食品中篩選到1株具有高抗氧化活性的酵母菌Y11，并將其鑒定為Aureobasidiumpullulans。這些研究結果與本研究結果相一致，說明酵母菌具有抑制和清除某些自由基的能力。在發酵食品中，釀酒酵母與馬克思克魯維酵母對食物風味做出的貢獻較大[11]37-39[18]47-48，而畢赤酵母一般因其產氣效應被視為污染菌[15]，本試驗中篩選出抗氧化活性較高的7株酵母中也未發現畢赤酵母。

(3) 關于這78株酵母菌的生理生化特性以及對新疆傳統發酵乳制品風味方面的作用有待進一步研究。

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