甲硫氨酸對小鼠毛發生長和臟器指數的影響

李曉鳳王 昕楊 兵張華琦

(1. 銅仁職業技術學院，貴州 銅仁 554300；2. 西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

甲硫氨酸(Met)是人和動物必需氨基酸之一，腺苷甲硫氨酸(SAM)是它的重要代謝產物之一[1]。SAM是Met通過腺苷三磷酸腺苷轉移酶(MAT)催化產生的，MAT有3種主要亞型：MAT I、MAT II和MAT III[2]。SAM是基因調控至關重要的甲基供體之一[2]。DNA甲基化和蛋白質甲基化(包括組蛋白甲基化)，是在甲基轉移酶催化、SAM作為甲基供體條件下完成的[3]。s-腺苷高半胱氨酸(SAH)為Met另一重要代謝產物，是通過甲基轉移酶(DNMTs)催化生成的，然后由SAH水解酶(AHCY)轉化為同型半胱氨酸(Hcy)[3]。因此，Met可通過以上2種代謝過程調控生物基因的甲基化狀態，從而改變基因表達和生物性狀。最新研究表明，Met參與骨骼微結構[4]、膠原蛋白特性[4]、胚胎干細胞維持[5]、胚胎發育[5]、葡萄糖耐受[6]和泌乳[7-8]等諸多生命過程。毛發生長周期分為生長期、退行期和休止期，該過程受到很多因素的影響，例如日照、遺傳和營養等[9-11]。然而，迄今為止，關于Met對模型動物(小鼠)的毛發生長、臟器指數的影響尚未見報道。基于此，本研究通過測量、計算不同Met濃度下小鼠的毛發直徑、長度以及部分臟器指數，為Met調控毛發生長及器官毒理作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小白鼠：25日齡昆明體重18～22 g，西安交通大學實驗動物中心；

Met：純度99.99%，江蘇鹽城品王貿易有限公司；

分析天平：BSM-220.3型，上海卓精儀器設備有限公司；

數顯游標卡尺：118型，臺州艾測五金專營店；

顯微測微尺：0.01 mm，泰州市誠倍教學設備有限公司；

手提式中藥粉碎機：BZFS-02型，西安寶正實業有限公司；

電熱鼓風干燥箱：DHG9000型，上海高致精密儀器有限公司；

真空干燥器：VA250-1型，上海君翼儀器設備有限公司；

凱氏定氮儀：K1160型，濟南海能儀器股份有限公司；

氨基酸自動分析儀：835-50型，日本日立公司。

1.2 試驗動物與分組

80只昆明小白鼠隨機分成4組，分別用0.12%(基礎日糧)，0.80%，1.60%，2.40%的Met處理，每組5個重復，每個重復雌、雄鼠各2只。試驗小鼠自由采食、飲水，籠養，每2 d 更換小鼠墊料。飼養室定時通風、采光，溫度控制在24 ℃左右，相對濕度60%左右。每天觀察記錄小白鼠采食、飲水、生長發育以及健康狀況。

1.3 基礎日糧原料組成及養分測定

(1) 基礎日糧水分：按GB/T 5009.3—2010執行。

(2) 干物質：按式(1)計算干物質。

(1)

式中：

D——干物質含量，%；

m1——烘干前樣品重量，g；

m2——105 ℃ 5 h烘干后樣品重量，g。

(3) 蛋白質：按GB 5009.5—2016執行。

(4) 脂肪：按GB/T 5009.6—2003執行。

(5) 灰分：按GB/T 5009.4—2010高溫灰化法執行。

(6) 能量：按GB 28050—2011和GB/Z 21922—2008執行。

(7) 氨基酸含量：采用日立835-50型氨基酸自動分析儀測定。

1.4 毛發直徑、長度的測量

在毛發退行期、休止期，每組采集10只小鼠左肩胛部毛發，分別采用顯微測微法測定毛發纖維直徑，采用數顯游標卡尺測定毛發自然長度。每只小鼠個體分別測定、記錄30根毛發的直徑、長度。

1.5 臟器指數的測定

在毛發退行期、休止期，每組斷髓處死雄鼠、雌鼠各5只，剝離心臟、脾臟、肺臟、肝臟、胸腺和腎臟等，準確稱量并記錄，計算各臟器的臟器指數。臟器指數按式(2)計算:

(2)

式中：

R——臟器指數；

w1——某一臟器重量，g；

w2——動物活體重量，g。

1.6 數據分析與統計

2 結果與分析

2.1 基礎日糧組成、營養水平及氨基酸含量

基礎日糧的原料組成、營養水平以及氨基酸含量分別見表1、2、3。

2.2 日糧Met對毛發生長的影響

毛發生長周期包括生長期、退行期和休止期，該過程受到諸多因素的影響，例如日照、遺傳及營養等[9-11]。由圖1可知，0.80%，1.60%，2.40% 3種處理顯著降低退行期毛發直徑，顯著降低退行期、休止期毛發長度(P<0.05)。退行期，0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的毛發直徑顯著低于0.12% 處理的(P<0.05)，0.80%，1.60% 2種處理的顯著低于2.40%處理的(P<0.05)，但0.80%與1.60% Met組差異不顯著(P>0.05)；休止期，各處理組毛發直徑差異不顯著(P>0.05)；退行期，0.80%，1.60% 2種處理的毛發長度顯著低于0.12%和2.40%處理的(P<0.05)，但0.80%處理與1.60%處理、0.12% 處理與2.40%處理的毛發長度差異不顯著(P>0.05)；休止期，0.80%，1.60% 2種處理的毛發長度顯著低于0.12%和2.40%處理的(P<0.05)，且1.60%處理的顯著低于0.80%處理的(P<0.05)，但0.12%處理與2.40%處理的毛發長度差異不顯著(P>0.05)。Zhang等[12]在蛋白質含量為24%日糧中添加0.74%Met，顯著提高貂的毛發長度與直徑(P<0.05)，與本研究結果恰好相反，此種現象差異可能是日糧中蛋白質水平、各種氨基酸含量、平衡狀態的差異或者三者共同作用的結果。另外，高濃度日糧Met可能增加機體整體甲基化程度，從而改變毛發生長密切相關的基因表達模式，最終抑制毛發生長[12]。

表1 基礎日糧的原料組成

表2 基礎日糧的營養價值(風干物質)

表3 基礎日糧的氨基酸含量(風干基礎)

*表示組間差異顯著(P<0.05)

2.3 日糧Met濃度對小鼠臟器指數的影響

研究表明，Met濃度對機體肝臟代謝和健康具有重要影響[13]。由圖2(a)可知，日糧Met濃度對小鼠毛發退行期心指數、肝指數和胸腺指數無顯著影響(P>0.05)，但對其他臟器指數有不同程度的影響。0.12%，0.80%，2.40% 3種處理的肝指數差異不顯著(P>0.05)，但1.60%處理的肝指數有增加趨勢(P=0.052)；0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的脾指數顯著高于0.12%處理的(P<0.05)，但前三者差異不顯著(P>0.05)； 0.80%，1.60% 2種處理的肺指數顯著高于0.12%和2.40%處理的(P<0.05)，但0.80%處理與1.60%處理、0.12% 處理與2.40%處理的差異均不顯著(P>0.05)；0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的腎指數顯著高于0.12%處理的(P<0.05)，但前三者差異亦不顯著(P>0.05)；各處理組心指數、胸腺指數差異不顯著(P>0.05)。

由圖2(b)可知，日糧Met濃度對小鼠毛發休止期心指數、脾指數無顯著影響(P>0.05)，但對其他臟器指數有不同程度影響。0.80%，1.60%，2.40% 3種處理的肝指數顯著低于0.12%處理的(P<0.05)，但前三者之間差異不顯著(P>0.05)； Sanchez-Roman等[14]對老年大鼠進行日糧Met限制，發現肝臟線粒體活性氧的產生減少，逆轉了機體衰老狀況。Eriksson等[15]發現日糧Met對維持小鼠肝臟細胞質還原狀態是必須的。本研究發現，休止期高濃度(0.80%和1.60%)Met顯著降低肝指數，即肝臟發生萎縮現象，可能是高濃度Met對肝細胞的毒性作用，影響到肝細胞的增殖和凋亡。

由圖2(b)可知，1.60%處理的肺指數、腎指數顯著高于0.12%，0.80%，2.40% 3種處理的(P<0.05)，但后三者之間差異不顯著(P>0.05)；1.60%，2.40% 2種處理的胸腺指數顯著高于0.80%處理的，2.40%處理的胸腺指數顯著高于0.12% 處理的(P<0.05)，但0.12%處理和1.60%處理的胸腺指數差異不顯著(P>0.05)；各處理組心指數、脾指數差異不顯著(P>0.05)。研究[16-17]表明，過量Met顯著降低腎臟的抗氧化能力，增加腎臟活性氧(ROS)的積累。Cooke等[16]研究顯示，Met小鼠腎臟涉及離子轉運的基因(Aqp2、Scnn1a、和Slc6a19等)發生上調受到限制，而這些基因參與維持滲透壓平衡，另外小鼠腎臟滲透壓的改變是腎臟發生萎縮或水腫的重要原因之一。本研究結果顯示：高濃度(0.80%和1.60%)Met顯著提高腎臟指數，即腎臟發生水腫現象，與Cooke等[16]研究基本相符，可能的機制是高濃度Met使維持肝臟滲透壓的基因(Aqp2、Scnn1a和Slc6a19等)表達發生變化，從而發生水腫。

*表示組間差異顯著(P<0.05)

2.4 性別對不同日糧Met濃度條件下休止期小鼠臟器指數的影響

由圖3可知，日糧Met濃度為1.60%時，雌鼠心指數顯著高于雄鼠(P<0.05)，其他Met濃度條件下差異不顯著(P>0.05)；日糧Met濃度為0.12%時，雌鼠肝指數顯著高于雄鼠(P<0.05)，其他Met濃度條件下差異不顯著(P>0.05)；日糧Met濃度為0.12%，2.40%時，雄鼠肝脾指數顯著高于雌鼠(P<0.05)，但日糧Met濃度為1.60%時，雌鼠肝脾指數顯著高于雄鼠(P<0.05)；雄鼠、雌鼠肺指數在不同硫氨酸濃度條件下無顯著差異，且肺指數具有相同的變化規律，即先升高后降低，當Met濃度為1.60%時，達到峰值(P>0.05)；當Met濃度為1.60%，2.40%時，雌鼠腎指數顯著高于雄鼠，其他Met濃度條件下差異不顯著(P>0.05)；在Met為0.12%，0.80%，1.60%，2.40%時，雄、雌鼠胸腺指數無顯著差異(P>0.05)。陳華等[18]研究表明，性別對Wistar大鼠、SD大鼠的心指數、腎指數和肝指數均無顯著性影響，但雄鼠的肺指數顯著低于雌鼠(P<0.05)，另外SD雄鼠的脾指數顯著低于雌鼠(P<0.05)。與本研究結果不一致，由此推測，Met濃度與性別可能存在互作關系，從而改變機體臟器指數。

*表示組間差異顯著(P<0.05)

3 結論

本研究通過不同Met濃度日糧處理小鼠，發現0.80% 和1.60% Met均顯著降低退行期、休止期毛發直徑和長度，且顯著提高退行期脾指數、肺指數和腎指數，原因可能是Met濃度改變了機體整體甲基化狀態以及臟器滲透壓調節相關的基因表達狀態。然而，具體的分子調控機制尚不清楚，有待進一步研究。

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