致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌外膜蛋白A對(duì)SD大鼠免疫保護(hù)作用研究

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小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)是一種人獸共患病原菌，感染這種病原體可引起廣泛的臨床表現(xiàn)，如急性腸炎、小腸結(jié)腸炎、末端回腸炎和腸系膜淋巴結(jié)炎，嚴(yán)重者還可引發(fā)一系列后遺癥如肝脾膿腫、關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、耶爾森肝炎和敗血癥等疾病[1]。OmpA是鑲嵌在革蘭陰性菌外膜上的一種產(chǎn)量豐富的β-桶裝蛋白，該蛋白不僅參與生物膜的形成，還可作為噬菌體和細(xì)菌素的受體，對(duì)于細(xì)菌具有重要的生理學(xué)功能[2-3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明OmpA在鼠疫耶爾森菌、沙門(mén)菌屬、溶血性曼氏桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中都具有良好的免疫原性[4-7]，提示OmpA有可能成為研制這些病原菌疫苗的候選蛋白。本課題組前期研究工作中已發(fā)現(xiàn)ompA核酸序列在三種致病性耶爾森菌中高度保守，并且在25 ℃和37 ℃下均是主要的免疫原性蛋白之一，體外免疫雜交實(shí)驗(yàn)證明該蛋白具有明顯的交叉免疫原性，具備作為致病性耶爾森菌的交叉免疫保護(hù)性抗原的潛力[8-10]。本研究使用純化的OmpA蛋白作為免疫原對(duì)大鼠進(jìn)行免疫，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)OmpA的免疫保護(hù)作用進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010(1b/O∶8)和Ye92010-ompA重組克隆子均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。SD雄性大鼠14只，SPF級(jí)，體重280～320 g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 His蛋白純化試劑盒購(gòu)于Novagen公司， BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，IPTG購(gòu)于Amresco公司，弗氏不完全佐劑購(gòu)于Sigma公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司，PBS(pH=7.4)購(gòu)于Gibco公司，改良?jí)埦?Peptone Sorbitol Bile Broth)購(gòu)于Fluka公司，O:8血清型分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社，PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑購(gòu)于TaKaRa公司，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3Ye92010-ompA的表達(dá)與純化[10]將重組克隆子Ye92010-ompA接種于具kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時(shí)加入終濃度1 mmol/L的IPTG，28 ℃培養(yǎng)誘導(dǎo)8 h。使用PBS(pH=7.4)將菌體清洗3次后重懸于binding buffer中，超聲裂解，5 500 r/min 離心10 min收集沉淀。將沉淀溶于含6 mol/L尿素的binding buffer中，冰浴1 h，再轉(zhuǎn)入His層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白通過(guò)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行驗(yàn)證，使用BCA蛋白定量試劑盒通過(guò)Bradford法對(duì)純化后蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.4OmpA免疫保護(hù)試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況見(jiàn)表1，SD大鼠被隨機(jī)分為OmpA免疫組(6只)、對(duì)照組(6只)和空白對(duì)照組(2只)。免疫組使用OmpA純化蛋白與弗氏不完全佐劑混合后(1.5∶1)通過(guò)腹股溝注射方式對(duì)大鼠進(jìn)行免疫，對(duì)照組由等體積的PBS代替蛋白。首次免疫(0.58 mg/只)后14 d對(duì)大鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫(1 mg/只)。攻毒試驗(yàn)使用致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010(低劑量組：106CFU、高劑量組：108CFU)通過(guò)腹腔注射方式進(jìn)行。攻毒后開(kāi)始為期3周的連續(xù)觀(guān)察，每日測(cè)量大鼠肛溫并采集糞便。

表1 OmpA免疫保護(hù)試驗(yàn)動(dòng)物分組

Tab.1 Animal grouping of OmpA immunoprotection test

動(dòng)物分組和攻毒劑量OmpA免疫組對(duì)照組空白對(duì)照組低劑量攻毒高劑量攻毒低劑量攻毒高劑量攻毒未做任何處理數(shù)量/只33332

1.5糞便排菌實(shí)驗(yàn)及PCR檢測(cè) 將大鼠糞便稱(chēng)重后按1∶2的比例接種于改良增菌液中，置于4 ℃培養(yǎng)7 d后對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行分離鑒定[11]。分別使用O∶8血清型診斷血清和PCR擴(kuò)增foxA、ail基因的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，引物序列及退火溫度參考文獻(xiàn)[12]。

1.6攻毒后大鼠肝、脾、腸病理切片制作與組織病理變化觀(guān)察 攻毒后21d將全部實(shí)驗(yàn)大鼠的肝、脾、回腸末端組織完整取下，觀(guān)察其大體形態(tài)。之后，使用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，置于光鏡下觀(guān)察組織的病理變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1OmpA蛋白表達(dá)與純化 將Ye92010-ompA重組克隆子表達(dá)后，采用His標(biāo)簽純化柱獲取目的蛋白OmpA，通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)所獲取的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示純化后的蛋白約38 kDa(圖1)。與預(yù)期結(jié)果相符[10]，BCA法測(cè)定目的蛋白濃度為2.01 mg/mL。

M：Marker；泳道1：未誘導(dǎo)的Ye92010-ompA重組克隆子全菌蛋白；泳道2：誘導(dǎo)后Ye92010-ompA重組克隆子全菌蛋白；泳道3：純化的Ye92010-OmpA圖1 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌OmpA表達(dá)純化SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of purified Ye92010-OmpA

2.2大鼠攻毒試驗(yàn) 使用Ye92010攻毒4 h后，OmpA免疫組與對(duì)照組大鼠均表現(xiàn)出厭食、被毛雜亂、糞便呈松軟非顆粒狀等癥狀，至第2 d有部分恢復(fù)、第4 d全部恢復(fù)正常。連續(xù)觀(guān)察3周，OmpA免疫組和對(duì)照組大鼠均未出現(xiàn)死亡，各組大鼠肛溫?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3糞便排菌檢測(cè) 使用Ye92010攻毒后，每日采集大鼠新鮮糞便，通過(guò)糞便分離培養(yǎng)和PCR對(duì)大鼠糞便排菌情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示兩組大鼠糞便排菌起始日均為攻毒后第3 d,其中OmpA免疫組中，經(jīng)低劑量和高劑量攻毒的大鼠糞便排菌時(shí)間均為14 d，而對(duì)照組中經(jīng)低劑量和高劑量攻毒的大鼠糞便排菌時(shí)間分別為17 d和21 d。相對(duì)于對(duì)照組，OmpA免疫組糞便排菌時(shí)間明顯縮短，說(shuō)明OmpA蛋白免疫原性良好。

2.4攻毒后大鼠肝、脾、腸大體形態(tài)觀(guān)察 將攻毒3周后的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行解剖并觀(guān)察各臟器的病理變化。由于Ye92010對(duì)大鼠具有較強(qiáng)的致病性，對(duì)照組大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理改變，可觀(guān)察到明顯的組織變性及壞死灶，雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大、肝臟黏連，甚至出現(xiàn)了腸膿腫和重度腸系膜液化等現(xiàn)象(圖2b1-b4)。相比較于對(duì)照組，OmpA免疫組大鼠癥狀較輕，僅出現(xiàn)輕度的皮下腫塊或脾腫大現(xiàn)象，腸管間界限模糊，腹股溝淋巴結(jié)腫大也僅局限于單側(cè)(圖2a1-a4)。空白對(duì)照組由于未經(jīng)攻毒而無(wú)病理學(xué)改變(圖2c1-c4)。

注：OmpA免疫組：經(jīng)OmpA免疫后，用Ye92010攻毒的大鼠大體形態(tài)；對(duì)照組：等體積PBS代替OmpA免疫后，用Ye92010攻毒的大鼠大體形態(tài)；空白對(duì)照組：未經(jīng)任何處理，正常飼養(yǎng)的大鼠大體形態(tài)a1：?jiǎn)蝹?cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大；a2：皮下腫塊；a3：輕度脾水腫 a4：腸管間界限模糊；b1：雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大；b2：肝臟黏連；b3：腸膿腫；b4：重度腸系膜液化；c1-c4：正常大鼠大體形態(tài)圖2 各組SD大鼠大體形態(tài)觀(guān)察Fig.2 Observation on general morphology of SD rats in each group

2.5細(xì)菌攻毒后大鼠肝組織病理學(xué)分析 在攻毒試驗(yàn)中，本研究同時(shí)進(jìn)行高、低菌量的攻毒方案。低劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠肝組織局部可見(jiàn)炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞)灶性浸潤(rùn)，肝組織輕度水腫，細(xì)胞胞漿染色變淺(圖3B)；對(duì)照組大鼠肝組織局部可見(jiàn)炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞)灶性浸潤(rùn)，肝組織水腫，細(xì)胞胞漿染色變淺，肝竇間隙水腫增寬(圖3D)。高劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠肝組織局部可見(jiàn)炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞為主)灶性浸潤(rùn)，肝組織其他結(jié)構(gòu)均正常(圖3C)；對(duì)照組大鼠肝組織局部可見(jiàn)炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞)灶性浸潤(rùn)，肝組織水腫，肝竇間隙水腫增寬(圖3E)。

A：正常肝組織；B：低劑量攻毒OmpA免疫組大鼠肝組織；C：高劑量攻毒OmpA免疫組大鼠肝組織；D：低劑量攻毒對(duì)照組大鼠肝組織；E：高劑量攻毒對(duì)照組大鼠肝組織黑色箭頭所示為炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，藍(lán)色箭頭所示為細(xì)胞胞漿染色變淺，紅色箭頭所示為肝竇間隙水腫增寬圖3 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010攻毒后各組SD大鼠肝組織病理學(xué)改變(×200)Fig.3 Histopathologic change of liver of SD rats infected with Ye92010 in each group(×200)

2.6細(xì)菌攻毒后大鼠脾組織病理學(xué)分析 低劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，脾竇大小正常，脾小結(jié)局部區(qū)域偶見(jiàn)濾泡中心變性壞死(圖4B)；對(duì)照組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，紅髓區(qū)域可見(jiàn)較多中性粒細(xì)胞散在浸潤(rùn)，脾竇結(jié)構(gòu)疏松伴輕度擴(kuò)張和紅髓腫脹，濾泡中心變性壞死(圖4D)。高劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，紅髓區(qū)域可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)疏松、水腫，伴少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4C)；對(duì)照組大鼠脾臟外膜完整覆蓋，局部區(qū)域脾臟結(jié)構(gòu)紊亂，脾竇結(jié)構(gòu)疏松伴輕度擴(kuò)張，紅髓腫脹且局部區(qū)域可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4E)。

2.7細(xì)菌攻毒后大鼠回腸組織病理學(xué)分析 低劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠回腸組織粘膜層可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞)散在浸潤(rùn)，伴有粘膜層及粘膜下層水腫(圖5B)。對(duì)照組大鼠回腸組織粘膜層可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞)廣泛浸潤(rùn)，粘膜下層可見(jiàn)淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)，組織整體水腫(圖5D)。高劑量攻毒組中，OmpA免疫組大鼠回腸組織粘膜層局部可見(jiàn)炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)散在浸潤(rùn)，伴有組織局部區(qū)域壞死，粘膜下層及肌層結(jié)構(gòu)正常(圖5C)。對(duì)照組大鼠回腸組織粘膜層可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞)廣泛浸潤(rùn)，粘膜下層組織水腫(圖5E)。

3 討 論

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌屬于腸桿菌科，是一種革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌。在歐洲，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是僅次于空腸彎曲菌和沙門(mén)氏菌的第三大人獸共患病病原菌；在我國(guó)，已知的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌暴發(fā)感染共2次，總計(jì)500多人[13-14]。但由于對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的監(jiān)測(cè)起步較晚，很多由該菌感染造成的疾病沒(méi)有得到很好的鑒定，故該菌的發(fā)病率在我國(guó)一直被嚴(yán)重低估，研制對(duì)抗致病性耶爾森菌的疫苗對(duì)于腸道疾病的預(yù)防和控制具有重大意義。近幾年，有大量研究表明OmpA是一種很好的免疫原性蛋白，可作為研制疫苗的候選蛋白。

A：正常脾組織；B：低劑量攻毒OmpA免疫組大鼠脾組織；C：高劑量攻毒OmpA免疫組大鼠脾組織；D：低劑量攻毒對(duì)照組大鼠脾組織；E：高劑量攻毒對(duì)照組大鼠脾組織黑色箭頭所示為濾泡中心變性壞死，紅色箭頭所示為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，藍(lán)色箭頭所示為紅髓腫脹，黃色箭頭所示為脾臟結(jié)構(gòu)紊亂圖4 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010攻毒后各組SD大鼠脾組織病理學(xué)改變(×200)Fig.4 Histopathologic change of spleen of SD rats infected with Ye92010 in each group(×200)

A：正常回腸組織；B：低劑量攻毒OmpA免疫組大鼠回腸組織；C：高劑量攻毒OmpA免疫組大鼠回腸組織； D：低劑量攻毒對(duì)照組大鼠回腸組織；E：高劑量攻毒對(duì)照組大鼠回腸組織紅色箭頭所示為粘膜層炎癥及水腫，藍(lán)色箭頭所示為粘膜下層炎癥及水腫，黃色箭頭所示為淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)圖5 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ye92010攻毒后各組SD大鼠回腸組織病理學(xué)改變(×200)Fig.5 Histopathologic change of ileum of SD rats infected with Ye92010 in each group(×200)

OmpA在革蘭陰性菌中廣泛存在，是最主要的外膜蛋白之一。有研究表明該蛋白主要通過(guò)粘附于粘膜表面、血清抵抗、侵襲、抗菌肽抵抗和使宿主細(xì)胞活化使細(xì)菌發(fā)揮致病作用，其高拷貝數(shù)和暴露于細(xì)菌表面的特性使其能促發(fā)固有免疫和適應(yīng)性免疫[15-16]。此外，OmpA可被中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶特異性識(shí)別，并且可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生較高水平的抗體，但其對(duì)被免疫動(dòng)物的免疫保護(hù)能力目前尚不清楚[17-18]。

在本課題組前期工作中已經(jīng)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，將三種序列性ompA克隆表達(dá)蛋白純化后分別免疫小鼠所得的血清與三個(gè)型的OmpA進(jìn)行免疫雜交，結(jié)果證實(shí)OmpA良好的交叉免疫原性。因此本研究的目的在于證實(shí)OmpA的這種免疫原性是否能給機(jī)體帶來(lái)免疫保護(hù)。本研究通過(guò)腹股溝注射的方式對(duì)大鼠進(jìn)行OmpA免疫，攻毒后通過(guò)糞便分離培養(yǎng)和PCR鑒定菌株。結(jié)果顯示經(jīng)高劑量攻毒的對(duì)照組排菌時(shí)間最長(zhǎng)，長(zhǎng)達(dá)21 d，且長(zhǎng)于低劑量攻毒對(duì)照組。而經(jīng)低劑量和高劑量攻毒的OmpA免疫組排菌時(shí)間相同，都在攻毒后14 d檢測(cè)不到排菌。排菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠經(jīng)OmpA免疫后，Ye92010在腸道的定植受到阻礙并被快速地從腸道清除。

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌具有嗜淋巴組織特征，感染小鼠后，在腸粘膜通過(guò)M細(xì)胞進(jìn)入下層的淋巴組織，即Peyer結(jié)，這種侵襲可致大量白細(xì)胞增生，并與細(xì)胞外小腸結(jié)腸炎耶爾森菌形成微小膿腫，還可通過(guò)血流或淋巴管播散到肝、脾等臟器，引發(fā)腸以外的其他臟器感染[19-20]。本研究需收集大鼠糞便進(jìn)行排菌檢測(cè)，故并未在急性感染期對(duì)大鼠進(jìn)行組織病理分析，而在其停止排菌后對(duì)所有大鼠進(jìn)行解剖，摘取肝、脾、腸，觀(guān)察組織病理學(xué)改變，研究致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌OmpA對(duì)大鼠的免疫保護(hù)作用。大體觀(guān)察結(jié)果顯示OmpA免疫組出現(xiàn)腹股溝淋巴結(jié)腫大、皮下腫塊、脾結(jié)節(jié)、輕度腸系膜液化，對(duì)照組出現(xiàn)腹股溝淋巴結(jié)腫大、脾結(jié)節(jié)、腸膿腫、脾膿腫、重度腸系膜液化，其中OmpA免疫組中，低劑量攻毒組和高劑量攻毒組各有一只大鼠未觀(guān)察到明顯的組織病變及壞死，我們認(rèn)為可能是由于大鼠個(gè)體差異。組織病理切片結(jié)果顯示OmpA免疫組和對(duì)照組所有大鼠均出現(xiàn)不同程度的組織病變，肝病變出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和輕度水腫，脾病變出現(xiàn)濾泡中心變性壞死、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腸病變出現(xiàn)粘膜層和粘膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫。與大體觀(guān)察結(jié)果中出現(xiàn)的臟器膿腫、液化較為一致，且均表現(xiàn)為OmpA免疫組的病變程度輕于對(duì)照組，說(shuō)明OmpA對(duì)大鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)。

綜上所述，致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌OmpA免疫大鼠后，可使大鼠抵抗致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的能力大大增強(qiáng)，排菌時(shí)間變短，組織病變變輕，OmpA對(duì)大鼠的免疫保護(hù)作用顯著。本研究表明OmpA不僅在體外水平表現(xiàn)出良好的免疫原性，更能在體內(nèi)水平給機(jī)體帶來(lái)免疫保護(hù)，結(jié)合OmpA在3種致病性耶爾森菌中高度保守的特點(diǎn)，推測(cè)OmpA可成為包括鼠疫在內(nèi)的致病性耶爾森菌疫苗的優(yōu)質(zhì)候選蛋白。

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