人用狂犬病疫苗和被動免疫制劑研發進展

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狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患疾病(由動物傳播到人類的疾病)?？袢《靖腥炯倚蠛鸵吧鷦游?，發病的動物通過咬傷或抓傷，將唾液中的病毒傳播至人。除南極洲外，其他各洲都存在狂犬病，但95%以上的人類死亡病例發生在亞洲和非洲。歐美發達國家以野生動物狂犬病為主。近30年來我國狂犬病例發病數最低的一年是1996年(159例)，此后逐年上升至2007年的3 300例，而后逐年下降，2015年病例數為801例[1]。我國計劃于2025年消滅人狂犬病。目前，主動與被動免疫接種仍是控制狂犬病的最有效手段，本文就兩類免疫制劑的研究現狀與進展進行了綜述。

1 狂犬病毒簡介和狂犬病主動被動預防措施

狂犬病毒(Rabies virus, RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)。外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內含有單鏈RNA。

狂犬病毒含有5種主要蛋白(L、N、G、P和M)，L蛋白(Large protein)具有轉錄作用；N蛋白(Nucleoprotein)是核衣殼蛋白，為組成病毒粒子的主要核蛋白，其包裹著狂犬病毒的RNA基因組；P蛋白(Phosphoprotein)和病毒復制、包裝及逃逸機體免疫反應有關；G蛋白(Glycoprotein)是構成病毒表面刺突的糖蛋白，是狂犬病病毒與細胞受體結合的結構，在狂犬病毒致病與免疫中起著關鍵作用；M(Matrix protein)蛋白是病毒的基質蛋白。

圖1 狂犬病毒基本結構Fig.1 Structure of rabies virus

狂犬病毒暴露前可以預防性接種狂犬病疫苗，通過主動免疫機制刺激機體產生抗狂犬病毒抗體。狂犬病毒暴露等級根據世界衛生組織(World Health Organization, WHO) 動物接觸分類標準可分為：Ⅰ類接觸(觸摸或飼養動物，或被動物舔舐完整的皮膚)，Ⅱ類接觸(造成輕微破損或無出血的輕微擦傷皮膚)，Ⅲ類接觸(穿透性的皮膚咬傷或抓傷，或粘膜污染)。

疑似狂犬病動物抓傷或咬傷(Ⅱ類和Ⅲ類接觸)后的正確處理為：肥皂水徹底清洗傷口并及時注射狂犬病疫苗(Ⅱ類接觸)或同時注射狂犬病疫苗和狂犬病免疫球蛋白(Ⅲ類接觸)。

2 人用狂犬病疫苗現狀和研發進展

狂犬病疫苗免疫后可以刺激機體產生抗病毒中和抗體，激活T淋巴輔助細胞及細胞毒性T細胞，保護動物免受病毒感染。我國每年接種1200-1500萬劑次的狂犬病疫苗，為全世界接種狂犬病疫苗最多的國家。最早期的狂犬病疫苗是在動物的神經組織中生產，采用的是干燥法滅活病毒法。后來的Semple疫苗采用化學滅活法(酚滅活)，需要連續接種14-21針[2]。雖然價格相對于細胞培養法生產的疫苗便宜，但接種次數太多且副作用大，WHO不推薦使用，我國已于1991年開始禁用神經組織疫苗。1955年左右開始由鳥類動物胚胎生產狂犬病疫苗(如鴨胚胎)。通過多輪的密度梯度離心去除非病毒脂質成分，并以β丙內酯滅活病毒。1967年開發了人類二倍體細胞(The human diploid cell vaccine, HDCV)。1970年代末開始又逐步開發了不同細胞培養系統生產的疫苗，如地鼠腎細胞、狗腎細胞、雞胚細胞和Vero細胞等[3]。目前國內生產的疫苗主要來源于Vero細胞培養，其次為人二倍體細胞和地鼠腎細胞。

細胞中生產病毒的成本高，生產過程中有風險，貯存和運輸需要低溫。目前的狂犬病疫苗接種次數仍然偏多，尤其是對于暴露后的接種，需要盡可能少的接種次數且能充分誘導機體產生足量保護性抗體?；跍p少狂犬病疫苗接種次數，價格及提高疫苗接種普及率和接種者依從性等方面的考慮，目前仍然有必要研發更為廉價、免疫原性更強和注射次數少的下一代狂犬病疫苗。

天然G蛋白在狂犬病毒包膜上為三聚體結構。G蛋白需要胞外區、跨膜區和胞內區同時表達方能形成具有正確空間結構的三聚體。正確折疊和糖基化修飾后，G蛋白具有充分的免疫原性，可誘發機體的體液免疫和細胞免疫。G蛋白也可以在感染細胞內表達并被轉運至細胞膜上。有效的抗體不但可以中和并清除狂犬病毒，其還可以通過抗體依賴性細胞毒作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)和補體依賴的細胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)清除被感染的細胞[4-5]。因此以G蛋白為抗原的疫苗是下一代疫苗研發的方向。但膜蛋白純化困難，純化過程中很難保持正確空間結構，一旦空間結構破壞即失去部分空間表位，免疫原性降低。

包括一個跨膜區，一個胞外區，一個胞內區，其中五個免疫原性區域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和a)位于胞外區。圖2 狂犬病毒G蛋白的結構示意圖Fig.2 Structure of rabies virus glycoprotein (G protein)

以下幾種系統曾經被嘗試用于表達和純化G蛋白。

2.1大腸桿菌表達系統 大腸桿菌表達系統技術成熟且重組蛋白產量高，但表達的G蛋白非可溶性，沒有翻譯后修飾如糖基化修飾。因此G蛋白不能正確折疊形成正確的空間結構，蛋白免疫原性差，不能作為抗原激發機體產生足夠強度中和抗體[6]。

2.2直接從培養的狂犬病毒中純化 狂犬病毒培養生產工藝繁瑣，對生物安全要求高，相對于減毒疫苗和滅活疫苗多了一步G蛋白純化步驟，大幅增加成本。盡管純化的G蛋白具有較好的免疫原性，但因為成本過高而沒有推廣應用價值[7-8]。

2.3昆蟲細胞表達系統 昆蟲細胞Sf9表達的G蛋白會被分泌到細胞膜上，一般會形成正確的三維結構并具有類似的生物學活性?？赡苡捎诜g后修飾機制不同，Sf9細胞表達的G蛋白分子量較哺乳動物細胞表達的小。通過將表達G蛋白的細胞或細胞裂解物作為免疫原免疫小鼠，可以產生中和抗體。但G蛋白純化提取工作繁瑣，成本高，限制了其推廣應用[9-11]。黑腹果蠅S2細胞也被用來作為宿主細胞表達G蛋白，表達G蛋白的S2細胞裂解物免疫小鼠可以誘導產生保護性抗體[12]。有學者應用生物反應器培養S2細胞來表達G蛋白，并就生物反應器的S2細胞培養工藝進行了多方面優化，但依然面臨免G蛋白的提取純化問題，期待后續能夠在蛋白提取工藝上有所突破[13-15]。

2.4酵母細胞表達系統 酵母細胞是一種經濟高效的真核蛋白表達系統，可以成功實現胞內表達或分泌表達，成本低廉，培養條件要求不高，適宜工業放大。盡管酵母系統有以上諸多優點，但表達的G蛋白不能正確折疊，并有可能形成異常多聚體，此外酵母的高甘露糖糖基化修飾不利于G蛋白的穩定并對蛋白免疫原性有影響，動物實驗顯示酵母細胞表達的G蛋白能夠在被免疫的小鼠中產生中和抗體，但僅僅能保護肌肉內注射的毒株攻擊，不能保護大腦內注射的毒株攻擊[16-17]?；谝陨显?，酵母不適合作為G蛋白表達系統。

2.5轉基因植物表達 在植物如西紅柿中、煙葉和玉米中表達抗原蛋白具有生產成本低、物流成本低、給藥方便等優勢。植物中的G蛋白可經過進食在小鼠體內產生保護性免疫反應。植物表達系統的以下缺點限制了其大規模推廣應用： 1)劑量不好衡量，尤其是對于暴露后的免疫； 2)烹飪方式差異、進食咀嚼方式差異、消化道微環境和pH值差異影響了抗原蛋白的降解和接觸免疫系統的機會； 3)該類型抗原蛋白在人體中是否能夠引起有效的免疫反應尚無實驗結論[18-20]。

2.6哺乳動物細胞表達 哺乳動物細胞表達的G蛋白具有正確的翻譯后修飾和折疊，免疫原性好。但G蛋白提取時常用的去污劑是Triton X-100，這會造成G蛋白變性。從細胞膜上提取G蛋白比從病毒中提取過程要繁瑣許多。此外，和可溶性蛋白相比較，膜蛋白的產量低。有報道稱在MDBK細胞中表達了可溶性的G蛋白的胞外區，但因為沒有跨膜區域協助蛋白正確折疊，所表達的蛋白免疫原性弱，其表達的可溶性蛋白僅可用于診斷研究[21]。

懸浮培養的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)可達到很高的細胞密度(1-3×107/mL)，培養體系可達到2 000-10 000 L，蛋白產量高，且翻譯后修飾如糖基化類似于人體細胞，蛋白活性好，被廣泛用于表達各種治療性蛋白如單克隆抗體等。有研究采用CHO表達了可溶性的G蛋白胞外區，但僅表達可溶性的胞外區不能形成有強免疫原性的三聚體結構[22]。CHO細胞表達G蛋白目前主要用于G蛋白糖基化研究[23-26]。

除了利用上述不同系統表達和純化G蛋白外，將G蛋白基因導入接種者體內使其在接種者體內表達G蛋白也是狂犬疫苗的一個發展方向。

2.7核酸疫苗

2.7.1DNA疫苗 將含有G蛋白基因的質粒DNA通過鼻腔灌注、肌肉注射、皮下注射及基因槍等途徑導入實驗動物細胞內，表達的G蛋白可在兔子、貓、狗、小鼠和獼猴體內誘導免疫反應，產生中和抗體[27-30]。

2.7.2RNA疫苗 用含有狂犬病毒G蛋白基因的RNA作為疫苗免疫小鼠，小鼠產生的體液免疫和細胞免疫反應類似于DNA疫苗[31]。

雖然核酸疫苗具有生產成本低、易于運輸和保存等優點，但有整合入接種者基因組的風險(DNA疫苗)及產生免疫反應所需時間長、免疫反應較弱等缺點，不能用于狂犬病毒暴露后免疫，暴露前預防性接種的優勢也不大，以上諸多原因限制了其應用。

2.8利用病毒載體在被免疫動物體內表達G蛋白 利用病毒載體在動物體內表達G蛋白以激發機體的細胞和體液免疫是具有前景的方法[32]。病毒載體疫苗已在歐美發達國家野生動物狂犬病控制中得到廣泛應用且效果顯著。病毒載體基因組中含有G蛋白基因，可在接種者體內表達G蛋白，但病毒載體疫苗的一個缺點是：接種者體內如業已存在抗病毒載體抗體會抑制病毒載體的感染復制和G蛋白抗原的表達。

2.8.1痘病毒載體(Poxvirus)疫苗 痘苗病毒(Vaccinia)是痘病毒的一種。減毒痘病毒狂犬病疫苗已經被歐洲和美國用于免疫動物如紅狐貍、浣熊、郊狼、臭鼬等，有效地降低了狂犬病在上述野生動物中的發病率。減毒的痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus Ankara, MVA)在大部分細胞中不能復制，人體對其免疫耐受性好于普通痘苗病毒。但以MVA為載體的G蛋白疫苗在小鼠中的免疫原性不及普通痘苗病毒疫苗強[33]。痘苗病毒載體疫苗因為不能完全減毒且在誘導T細胞免疫方面的能力較弱因而人群中應用的前景不大。

2.8.2腺病毒(Adenovirus, Ad)載體疫苗 腺病毒能感染人的呼吸道、消化道、尿道、膀胱和眼等組織和器官，其基因不能整合入人體基因組，沒有潛在的致癌能力，安全性也已經得到認證[34-35]。

其中人腺病毒5型(Adenovirus human serotype 5, AdHu5)載體疫苗使用的AdHu5刪除了E1基因，是一種復制缺陷型病毒。AdHu5誘導的體液免疫和細胞免疫水平遠遠高于痘苗病毒和DNA病毒。因病毒不能復制，減少了其在免疫缺陷人群中應用的風險。但因普通人群AdHu5抗體陽性率較高，限制了其應用[36-37]。

采用黑猩猩腺病毒(Adenovirus Chimpanzee-Derived Serotypes, AdC)載體構建的疫苗因人群中普遍不含抗AdC抗體，表達G蛋白的AdC在經肌肉注射、口腔或鼻腔免疫小鼠一次后可產生持久保護性抗體[38-39]。目前，基于AdC3的Ebola疫苗已經完成一期臨床試驗，受試者肌肉注射疫苗一次，耐受性良好且產生的抗體可以持續到接種后48周，二期臨床試驗在進行中[40-41]。鑒于Ebola AdC病毒疫苗的臨床研究結果，狂犬病AdC疫苗前景樂觀。

綜上所述，G蛋白提取困難導致其成本居高不下，G蛋白亞單位疫苗目前不具備大規模推廣應用條件。病毒載體疫苗尤其腺病毒載體安全、有效、經濟、使用方便，是下一代人狂犬病疫苗的發展方向。

3 狂犬病被動免疫制劑現狀和研發進展

3.1狂犬病免疫球蛋白 狂犬病疫苗注射到產生有效抗體需要14 d左右時間，在產生有效抗體前的約2周的窗口期需要狂犬病被動免疫制劑如狂犬病免疫球蛋白來中和傷口附近可能存在的狂犬病毒?？袢∶庖咔虻鞍鬃⑸浜竽軌蛄⒓粗泻蛡诰植康拇蟛糠植《荆柚共《緮U散并侵入神經系統?？袢∶庖咔虻鞍椎陌胨テ跒?4～21 d，可為疫苗誘發主動免疫贏得時間。狂犬病被動免疫制劑和疫苗聯合應用，可以最大限度地預防狂犬病發生。

目前市場上的狂犬病免疫球蛋白有兩種。

3.1.1馬源狂犬病免疫球蛋白(Equine rabies immunoglobulin, ERIG) 狂犬病毒免疫馬匹采集血漿，經胃酶消化后，用硫酸胺鹽析法制得的液體或凍干的免疫球蛋白制劑。因屬于異源性蛋白，注射后過敏反應多見，程度輕重不一，嚴重者可致人死亡。

3.1.2人源狂犬病免疫球蛋白(Human rabies immunoglobulin, HRIG) 先用乙型肝炎疫苗免疫健康人后再經人用狂犬病疫苗免疫獲得血漿，經提取、滅活病毒制成人抗狂犬病毒免疫球蛋白。缺點是來源有限，價格昂貴。一般無不良反應，少數人有紅腫、疼痛感，無需特殊處理，可自行恢復。

ERIG和HRIG供應量有限，價格偏高，在狂犬病呈地方性流行的不發達地區難以普及。且疫苗聯合HRIG或ERIG應用并不能保護所有狂犬病毒屬血清型的感染[42-43]。

3.2狂犬病毒單克隆中和抗體(monoclonal antibody, mAb) 特異性的單克隆抗體相較于狂犬病免疫球蛋白，具有安全性好，特異性強，用量小，成本低，可大量生產等優點。效果與HRIG近似，適用于暴露后治療，臨床應用前景廣闊。 一個單克隆抗體只能識別一個抗原表位，因此一般將數個單克隆抗體混合使用[44]。WHO推薦開發抗狂犬病G蛋白的單克隆抗體并且使用多個抗體的混合制劑以替代現有的HRIG或ERIG[45]。

國內外目前處于開發階段的抗狂犬病毒單克隆抗體有：

3.2.1MassBiologics和印度血清研究所(Serum of Institute of India)共同開發的RAB1(I7C7)，該單克隆抗體的表達細胞是CHO，結合的抗原表位在胞外區免疫原性區域III[46-47]。該單抗雖不能結合狂犬病毒所有血清型的G蛋白[48]，但對絕大多數已知的狂犬病毒血清型中和效果良好，目前印度正在進行二期與三期臨床試驗。

3.2.2Crucell Holland BV開發的CL184(CR57和CR4098兩個單抗的混合制劑，兩個單抗結合表位分別位于免疫原性區域I和III)，表達細胞為Per.C6。雖然兩種抗體聯合使用可以結合絕大部分狂犬病毒株，但因抗體不能結合中和所有狂犬病毒毒株而暫時終止二期臨床試驗[49-51]?？紤]到不同區域狂犬病毒流行株的差異，該單克隆抗體混合制劑依然有巨大的開發價值。

3.2.3RVC20和RVC58(分別結合位于免疫原性區域I和III的表位)為新報道的抗狂犬病毒G蛋白單克隆抗體，表達細胞為Per.C6，可以中和所有35種狂犬病毒，效果優于CR57，CR4098和RAB1，目前處于臨床研究前期[52]。

3.2.4SYN023(CTB011和CTB012兩個單抗的混合制劑)是另一組新報道的人源化抗狂犬病毒G蛋白單抗混合物，和HRIG在動物中的保護效果相當。表達細胞為CHO-DG44，動物試驗中接種劑量0.03 mg/kg即可達到保護效果。CTB011結合表位為免疫原性區域III和其附近區域，CTB011結合表位為多個不連續的保守的氨基酸形成的空間表位，不屬于已經報道的G蛋白免疫原性區域。初步研究表明SYN023可以中和中國流行的15株狂犬病毒毒株和北美地區流行的12株狂犬病毒株，目前處于臨床研究前期[53]。

3.2.5我國目前在人源抗狂犬病毒G蛋白單克隆抗體(mAb)的研究已處于世界前列。國內多家學術科研機構報道了抗狂犬病毒G蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及中和作用效果[54-56]。其中，華北制藥集團從2003年開始進行人源化抗狂犬病毒單克隆抗體(NM57)的研發工作，已得到了高水平表達工程細胞株，對制備得到的HuMAbs純品進行了充分鑒定，用狂犬病毒標準攻擊毒株(CVS)以及中國有代表性的街毒株進行了中和試驗，結果顯示NM57對狂犬病毒有明確的中和作用。同時，在街毒株的攻擊實驗中，顯示了優于市售HRIG的保護率[57-58]。NM57為CHO細胞表達的單克隆抗體，與Crucell Holland BV開發的CR57(表達系統為Per.C6細胞)一樣源于單克隆抗體SO57株(表達系統為BSR細胞)，NM57的中和靶位為狂犬病毒G蛋白高度保守的免疫原性區域I[58-60], NM57已于2013年完成一期臨床試驗，安全性良好[61]。2016年底已完成二期臨床試驗，抗體特異性好，注射所需量約為1mg/人份，用量約為血源抗狂犬病免疫球蛋白的千分之一，預計可以顯著壓縮價格至傳統HRIG的1/3。雖然其不能保護所有的狂犬病毒株感染，但針對中國的狂犬病毒流行株，是可以起到有效保護作用的。該單克隆抗體的上市后必定會對我國狂犬病防治產生重大正面促進作用。

4 結 語

發達國家已基本消除人和家養寵物的狂犬病，將狂犬病預防重心轉移到野生動物上，并取得了顯著成果。盡管現有的狂犬病毒滅活疫苗需要暴露前注射3針，暴露后需要注射4～5針，但在發達國家狂犬病極其罕見，市場需求少，疫苗公司缺乏動力研發新型疫苗。對于經濟落后國家，更為簡便經濟的疫苗仍存在很大需求。

對于暴露前的大規模預防接種尤其需要這種疫苗具有絕對的安全性、經濟性以及免疫的持久性，腺病毒載體疫苗尤其是黑猩猩腺病毒載體疫苗可以滿足這方面的要求。對于暴露后接種，需要疫苗能夠在盡量短的時間內誘發機體的免疫反應。這種情況下DNA疫苗因為誘導免疫反應所需時間長，不是好的選擇?？梢赃x擇已有的滅活病毒疫苗或病毒載體疫苗結合狂犬病毒免疫球蛋白或單克隆中和抗體。相信隨著研發的進展，基于狂犬病毒G蛋白的更為廉價方便的疫苗會在不久的將來會問世。

對于可能替代狂犬病毒抗血清的單克隆抗體，雖然其對生產技術要求高，但其優點不言而喻，可大規模生產降低成本，批次間效價的差異小，可以做成干粉，方便運輸和貯存，提高保存期且更容易在偏遠地區運用?？袢《究寡宀荒芴峁?00%的保護，狂犬病毒單克隆抗體也存在同樣問題。目前在研的單克隆抗體，其結合的表位均位于相對保守的區域。單個抗體不能中和所有毒株，會有免疫逃逸株出現[49-51]。WHO推薦使用混合制劑，將兩種或兩種以上識別不同表位的抗體聯合使用。混合制劑具有以下特點：高效價，識別G蛋白上不同的無重合區域的表位，能中和盡可能多的毒株，可以顯著減少或消除免疫逃逸毒株。

對于在中國和印度進行臨床試驗的單個單克隆抗體制劑，無疑存在免疫逃逸株的問題，但考慮到中印兩國狂犬病毒流行株的流行情況，其使用是可以達到中和當地流行的毒株目的。單一抗體制劑的生產工藝和成本較兩種或兩種以上抗體混合制劑要低。相對于HRIG或ERIG的昂貴及短缺，其在中印這兩個狂犬病高發國家控制和減低暴露后風險還是有意義的。當然以后的發展方向還是混合制劑。

隨著時間的推進仍有可能會產生由基因突變和基因交換而來的新免疫逃逸株。就此問題需要結合狂犬病毒流行株分子流行病學上的監控數據，針對狂犬病毒流行株的變異情況，不斷更新單克隆抗體混合制劑，提高抗體的保護范圍，減少免疫逃逸株的出現。

隨著新一代狂犬病疫苗以及狂犬病毒單克隆抗體的研發和應用，有信心期待2025在中國消滅人狂犬病，進而消滅家養寵物狂犬病并有效控制野生食肉動物狂犬病。

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