重癥急性胰腺炎患者外周血NK細胞上Tim-3的表達研究

劉文平 ，謝勇 ，諸葛雅麗

(1、南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006；2、南昌大學基礎醫學院免疫學教研室，江西 南昌330006；3、南昌大學第一附屬醫院消化研究所，江西 南昌330006)

重癥急性胰腺炎 （severe acute pancreatitis，SAP）是消化系統危重癥疾病，病程進展快，患者早期即可出現全身炎癥反應綜合癥（systemtic inflammatory response syndrome，SIRS），繼而發展為多器官功能障礙綜合癥 （multiple organ dysfunction syndrome，MODS），病死率高達 20%～30%[1]。目前越來越多的學者認為抗炎－抑炎平衡紊亂致使機體不足以拮抗過度的炎癥是重癥急性胰腺炎發生的核心問題[2]。 自然殺傷（natural killer，NK）細胞作為機體免疫系統的重要組成部分，在抗感染、抗腫瘤及移植排斥中起著十分重要的作用，其中NK細胞在SAP發生發展過程中的作用也逐漸引起了人們的關注。

T細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域相關分子3（T cell immunoglobulin－and mucin－domain－containing molecule－3，Tim－3）是 Tim 基因家族中的一個重要成員，是一個具有多種生物學功能的免疫調節分子[3]。Tim－3可通過與其配體Galectin－9結合可特異性誘導Th1細胞凋亡，從而負向調控Th1反應，是一種在T細胞耐受、自身免疫、慢性感染中有重要作用的負性共刺激分子[4]。近年研究證實，Tim－3可調控NK細胞的功能，參與機體免疫應答過程[5]。目前，尚未見有關SAP患者外周血NK細胞上Tim－3表達的報道。本研究應用流式細胞術檢測SAP患者和健康志愿者外周血NK細胞表面Tim－3分子表達情況，初步探討NK細胞上的Tim－3在SAP發生發展中的免疫學作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取南昌大學第一附屬醫院2016年6月至2017年6月收治的62例初診SAP為研究對象，其中男38例，女24例，年齡22～80歲，中位年齡53歲。SAP患者均未進行過抗炎治療、放療、化療、中西醫結合治療及生物治療，且無合并其他腫瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病等。健康對照組為同期南昌大學第一附屬醫院對照中心性別、年齡匹配的25例健康體檢者，其中男17例，女8例，年齡25～76歲，中位年齡51歲，所有健康對照者既往體檢，無感染性疾病及自身免疫性疾病等。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑和設備 抗人 Tim－3－PE、CD－56－PECy5、CD3－FITC、IgG1－PE 抗體均購自美國 eBioscience公司，人外周血溶血素購自美國Beckman Coulter公司，人淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司，Cytomics FC 500型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本的收集 SAP患者入院第2d清晨空腹抽取抗凝靜脈血，健康對照者對照當天清晨空腹抽取抗凝靜脈血。抗凝靜脈血標本完成臨床檢測后當天進行流式細胞檢測。

1.3.2 流式細胞儀檢測NK細胞上Tim－3的表達抗凝靜脈血用密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC），PBMC采用200μl PBS重懸備用，每個流式管加入50μl細胞懸液，對照管加入 CD3－FITC、CD56－PECy5、IgGl－PE 各 5μl；測定管依次加入 CD3－FITC、CD56－PE－Cy5、Tim 3－PE 各 5μl， 室溫避光溫育15min， 加 PBS 2ml混勻，1500r/min 離心 5min，重復洗2次后棄上清液，加入PBS 500μl重懸細胞。將重懸的細胞避光上機檢測。檢測結束后采用Cytomics FC 500流式細胞儀軟件對 NK （CD3－CD56+）細胞進行數據分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。以 Kolmogorov－Smirnov檢驗（K－S 檢驗）對數據進行正態分布檢驗，符合正態分布計量資料以（±s）表示，兩樣本均數比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數 （上四分位數，下四分位數）表示，兩組間資料數據比較采用Mann－Whitney U檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAP患者外周血NK細胞檢測結果 SAP患者與健康對照者外周血NK細胞占PBMC比例分別為（6.01±3.75）%和（12.51±3.41）%，SAP 患者外周血NK細胞占PBMC比例較健康對照者顯著下降，差異有統計學意義（t=7.50，P＜0.01），見圖 1。

2.2 SAP患者外周血NK細胞上Tim－3的表達情況 SAP患者與健康對照者外周血NK細胞上Tim－3 表達水平分別為 [23.25 （9.63，44.33）]%和[9.60 （5.05，11.25）]%，SAP 患者外周血 NK 細胞上Tim－3表達水平較健康對照者顯著升高，差異具有統計學意義（U=362.50，P＜0.01），見圖 2。

3 討論

NK細胞是抵抗病原體的固有免疫反應的第一道防線，具有多種生物學功能，除分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子發揮直接抗感染外，NK細胞可與靶細胞密切接觸，通過多種途徑發揮殺傷效應。此外，NK細胞還通過殺傷未成熟DCs、活化CD4+T細胞及超活化巨噬細胞等，進行負反饋調節，降低發生免疫紊亂風險[6]。因此，NK細胞不僅對機體感染微生物有很好防御作用，也可防止由于微生物感染導致的過度免疫應答[7]。目前，關于SAP患者外周血NK細胞的比例研究較少，本研究表明SAP患者外周血NK細胞比例與健康者相比顯著降低，低數量的NK細胞可能對機體的免疫防御功能有影響，使其不能有效發揮抗感染作用。

NK細胞的殺傷功能主要依賴于活化性受體與抑制性受體之間的相互平衡[8]。近年研究證實，NK細胞表面不僅表達活化性受體和抑制性受體，也表達著共刺激分子，其中負性共刺激分子是現今NK細胞功能研究的熱點[9]。Tim-3是機體中重要的負性共刺激分子，在T淋巴細胞、巨噬細胞等均有表達[10]。隨著研究的深入，研究者發現Tim-3在NK細胞也有表達，可調控NK細胞的功能，在感染性疾病及腫瘤的發生發展過程中均發揮重要作用[11]。如，在慢性乙肝感染過程中，NK細胞表面Tim-3表達顯著升高，且Tim-3負性調控患者NK細胞的活性，導致NK細胞功能抑制，阻斷Tim-3通路后可恢復NK功能[12]。Huang等[13]研究發現，在結核病患者中，外周血NK細胞Tim-3表達升高，阻斷Tim-3通路后可增強NK細胞對結核菌的殺菌能力和抗原提呈功能。在腫瘤研究領域，Wang等[14]研究發現，胃癌患者Tim-3的表達水平顯著高于健康對照，在發生轉移或臨床分期晚的胃癌患者，NK細胞上Tim-3的表達水平則更高，提示Tim-3在胃癌發生發展中發揮著一定作用。

本研究采用流式細胞術對62例初診SAP患者及25例健康對照者外周血NK細胞表面Tim-3的表達進行了檢測，結果發現SAP患者NK細胞表面Tim-3表達的陽性率顯著高于健康對照者，提示，Tim-3可能參與了SAP患者NK細胞功能的調控。由于本研究樣本數較少，今后我們將進一步擴大樣本量，深入探討SAP患者Tim-3對NK細胞的功能影響。

綜上所述，本研究發現Tim-3在SAP患者外周血NK細胞上表達顯著升高。進一步探究Tim-3在SAP中的生物學功能及其分子機制，或將為SAP的診治提供新的靶點。

[1]Portelli M，Jones CD.Severe acute pancreatitis：pathogenesis，diagnosis and surgical management[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2017，16(2)：155-159.

[2]方歡歡，熊姿，王文娟，等.外周血CD64、CD11b/CD18指數對急性胰腺炎并感染的早期診斷價值[J].實驗與檢驗醫學，2016，34(3)：304-307.

[3]Hu XH，Tang MX，Mor G，et al.Tim-3：Expression on immune cells and roles at the maternal-fetal interface[J].J Reprod Immunol，2016，118：92-99.

[4]Das M，Zhu C，Kuchroo VK.Tim-3 and its role in regulating antitumor immunity[J].Immunol Rev，2017，276(1)：97-111.

[5]Liu Y，Gao LF，Liang XH，et al.Role of Tim-3 in hepatitis B virus infection：An overview [J].World J Gastroenterol，2016，22(7)：2294-2303.

[6]Peng H，Tian Z.Natural Killer Cell Memory：Progress and Implications[J].Front Immunol，2017，8：1143.

[7]Bi J，Tian Z.NK Cell Exhaustion[J].Front Immunol，2017，8：760.

[8]Chiossone L，Vienne M，Kerdiles YM，et al.Natural killer cell immunotherapies against cancer：checkpoint inhibitors and more[J].Semin Immunol，2017，31：55-63.

[9]Malmberg KJ，Carlsten M，Bj?rklund A，et al.Natural killer cellmediated immunosurveillance of human cancer[J].Semin Immunol，2017，31：20-29.

[10]Yu A，Zhang X，Li M，et al.Tim-3 enhances brain inflammation by promoting M1 macrophage polarization following intracerebral hemorrhage in mice[J].Int Immunopharmacol，2017，53：143-148.

[11]Das M，Zhu C，Kuchroo VK.Tim-3 and its role in regulating anti-tumor immunity[J].Immunol Rev，2017，276(1)：97-111.

[12]Liu Y，Gao LF，Liang XH，et al.Role of Tim-3 in hepatitis B virus infection：An overview[J].World J Gastroenterol，2016，22(7)：2294-2303.

[13]Huang Z，Yao F，Deng Z，et al.Elevated expression of Tim-3 on CD56dimCD16+NK cells correlates with disease severity of pulmonary tuberculosis[J].Int J Clin Exp Pathol，2017，10(5)：5031-5038.

[14]Wang Z，Zhu J，Gu H，et al.The Clinical Significance of Abnormal Tim-3 Expression on NK Cells from Patients with Gastric Cancer[J].Immunol Invest，2015，44(6)：578-589.