DNA倍體分析與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)對(duì)良惡性漿膜腔積液診斷的比較

何秋陽(yáng)，鐘國(guó)梁，楊國(guó)順，張燦清，馬順高

(大理白族自治州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 大理671000)

漿膜腔積液是一種重要的病情標(biāo)志，可分為漏出性、炎性及惡性三大類(lèi)，臨床上漿膜腔積液的性質(zhì)關(guān)乎病情的治療策略[1]。目前，利用顯微鏡檢查漿膜腔積液的脫落細(xì)胞是確診其性質(zhì)重要手段，但該方法易受取材、檢驗(yàn)者個(gè)人經(jīng)驗(yàn)等因素影響，導(dǎo)致其檢出率低。因此如何提高惡性漿膜腔積液的檢出率已成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。惡性腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)和含量的異常是其基本生物學(xué)特征之一，基于該特征，使得利用流式細(xì)胞術(shù)的DNA倍體分析技術(shù)檢測(cè)漿膜腔脫落細(xì)胞中的DNA含量成為明確其性質(zhì)的又一重要途徑[2]。盡管DNA倍體分析在細(xì)胞鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸普及，但其對(duì)漿膜腔積液性質(zhì)的診斷尚需進(jìn)一步證實(shí)。本研究應(yīng)用用流式細(xì)胞儀 (flowcytometer，F(xiàn)CM)和Meta分析系統(tǒng)對(duì)經(jīng)臨床確診的95例良性及68例惡性漿膜腔積液樣本進(jìn)行DNA倍體分析，同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡檢查，探討DNA倍體分析技術(shù)在良惡性漿膜腔積液診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年 4月－2015年2月本院收治的漿膜腔積液患者163例，男94例，女69例，年齡 20～88 歲，平均年齡(55.7±15.8)歲。 全部病例均經(jīng)臨床最終確診，良性漿膜腔積液95例，惡性漿膜腔積液68例。所有檢查均采用同一次抽取的胸水標(biāo)。

1.2 儀器與試劑 采用美國(guó)BECKMAN COULTER公司的XL/MCL流式細(xì)胞儀及該公司生產(chǎn)的分析試劑。

1.3 方法

1.3.1 FCM檢測(cè) 取積液50ml離心后去上清液，加10ml PBS液洗滌2次后再調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至5×106/L，采用貝克曼公司提供的試劑破膜、溶血，加入PIN熒光染色劑與細(xì)胞結(jié)合15min。以正常人外周血淋巴細(xì)胞為對(duì)照。測(cè)定DI值。

1.3.2 細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 胸水經(jīng)離心沉淀后制片用劉氏染液染色，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡下觀察脫落細(xì)胞形態(tài)。陽(yáng)性為檢出異形細(xì)胞（疑為癌細(xì)胞）、檢出惡性細(xì)胞和檢出癌細(xì)胞；陰性為未檢出惡性細(xì)胞。

1.4 FCM 檢測(cè) 良、惡性判斷標(biāo)準(zhǔn)[3，4]：⑴正常二倍體細(xì)胞 DI值為 0.9～1.1，其余均為異倍體。 ⑵出現(xiàn)DNA的非整倍體(即發(fā)現(xiàn)異倍體)為惡性。⑶無(wú)明顯的非整倍體峰，但有一突出的四倍體峰和大于15%的S期細(xì)胞，并伴有G0/GI期CV值大于9%為惡性。⑷無(wú)明顯的非整倍體，但G0/GI期CV值增大，并伴有大于10～15%的S期和一個(gè)突出的四倍體峰，為可疑惡性。（見(jiàn)圖1和圖2）

圖1 DNA倍體分析（正常二倍體）

圖2 DNA倍體分析（異倍體）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件包，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

本研究共收集163例漿膜腔積液樣本，其中惡性積液樣本68例，良性積液樣本95例。DNA倍體分析方法對(duì)惡性積液樣本檢測(cè)的靈敏度及特異性分別為75%、97.9%，陰性預(yù)測(cè)值及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為 84.5%、96.2%；漿膜腔積液脫落細(xì)胞鏡檢對(duì)惡性積液樣本的靈敏度及特異性分別為42.6%、100%，陰性預(yù)測(cè)值及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為70.9%、100%；而兩種方法的聯(lián)合靈敏度為95.6%，聯(lián)合特異性為1（見(jiàn)表1）。上述結(jié)果經(jīng)卡方檢驗(yàn)表明，DNA倍體分析的靈敏度及陰性預(yù)測(cè)值均顯著高于傳統(tǒng)的脫落細(xì)胞鏡檢（P＜0.01），且兩種方法的聯(lián)合靈敏度均高于單一檢測(cè)方法（P＜0.05），但兩種方法的特異性及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值無(wú)差異，且與聯(lián)合特異性也無(wú)顯著差異。

3 討論

傳統(tǒng)的顯微鏡檢查漿膜腔積液脫落細(xì)胞是鑒別良、惡性的金標(biāo)準(zhǔn)，但惡性腫瘤細(xì)胞檢出率低，同時(shí)有些細(xì)胞介于良惡性之間，很難做出診斷[5]。細(xì)胞學(xué)檢查能診斷出1/2～2/3的惡性漿膜腔積液[6]。但在惡性漿膜腔積液早期，僅有少量細(xì)胞為惡性時(shí)診斷較困難。DNA倍體是指一個(gè)個(gè)體細(xì)胞所含染色體組的數(shù)目，單倍體細(xì)胞是僅含一個(gè)染色體組的細(xì)胞，二倍體細(xì)胞是含二個(gè)染色體組的細(xì)胞，如果某個(gè)體細(xì)胞的染色體比二倍體多或少一條染色體，都稱(chēng)為異倍體。由于測(cè)定細(xì)胞核DNA含量比計(jì)數(shù)核中染色體的數(shù)目容易，簡(jiǎn)單方便，故倍體通常理解為細(xì)胞核DNA的含量，而相應(yīng)的細(xì)胞稱(chēng)為二倍體，多倍體和異倍體[7，8]。人體正常的體細(xì)胞均有較恒定的DNA二倍體含量，而在細(xì)胞癌變過(guò)程中將伴隨細(xì)胞DNA含量的異常改變，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)DNA含量異常時(shí)，用FCM檢測(cè)可檢出DNA異倍體[9，10]。流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)70年代逐漸發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新的細(xì)胞分析技術(shù)，集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)等多門(mén)技術(shù)為一體。近二十年來(lái)，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分析DNA逐漸成為鑒別漿膜腔積液良惡性的輔助方法[11，12]。本研究也顯示，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行漿膜腔積液DNA倍體分析敏感性67．6%，明顯高于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡檢查39．7%，特異性93．7%，略低于顯微鏡檢查97．9%，和賈留群[13]等報(bào)道敏感度74%，特異度高0．94%基本相符，采用漿膜腔積液脫落細(xì)胞DNA倍體分析來(lái)判斷積液的良惡性存在一定的假陰性和假陽(yáng)性[14]，本文檢測(cè)結(jié)果表明，其假陰性和假陽(yáng)性分別為32．4%和6．3%，造成假陰性的主要原因是腫瘤細(xì)胞未脫落至漿膜腔；DNA異倍體檢測(cè)需要相當(dāng)數(shù)量的DNA異常細(xì)胞，較小的染色體異常可能不能被流式細(xì)胞儀檢測(cè)到；非整倍體峰太小被整倍體峰掩蓋；某些腫瘤細(xì)胞DNA的丟失和復(fù)制平衡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凈DNA正常[15]；另外也與高分化的二倍體腫瘤有關(guān)；假陽(yáng)性可能是與漿膜腔積液中存在大量的炎性細(xì)胞和多核細(xì)胞等有關(guān)。運(yùn)用漿膜腔積液脫落細(xì)胞DNA倍體分析來(lái)判斷積液性質(zhì)，可以提高陽(yáng)性檢出率，適合于脫落細(xì)胞的良惡性質(zhì)判斷篩查，兩種聯(lián)合有助于提高惡性漿膜腔積液診斷的敏感性和特異性，且可進(jìn)行早期癌前診斷，對(duì)于了解腫瘤細(xì)胞的增殖情況及惡性程度和預(yù)后也有重要的臨床意義。

表1 DNA倍體分析及鏡檢方法對(duì)163例漿膜腔積液脫落細(xì)胞的檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

[1]問(wèn)亞鋒，金恂，李軍．惡性胸腔積液中DNA倍體分析的診斷價(jià)值[J]．實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，27(5)：560－560．

[2]賈留群，郭姝瑾，萬(wàn)春．DNA異倍體檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液診斷價(jià)值的 Meta 分析[J]．西部醫(yī)學(xué)，2013，25(1)：16－19．

[3]Joseph E，F(xiàn)uhr JE，Anthory A，et al．Flow cytometry analysis of pul－monary fluids and cells for the detection of malignancies[J]．AM JPathol，1992，141(1)：218．

[4]逯海，陳勇，張斌．細(xì)胞DNA倍體分析在食管癌臨床診斷 和疾病程度及預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值 [J]．中國(guó)醫(yī)藥，2017，12(9)：1379－1382．

[5]Tetsuo s．Differential diagnosisof pleural effusions[J]．JMAJ，2006，49(9)：315－319．

[6]Vladutin A，Brason F，Adler R．Differential diagnosisof pleuraleffusions[J]．CHEST，1981，79(3)：297－301．

[7]Abaza R，DiazLK Jr，Laskin，et al．Prognostic value of DNA ploidy，bcl－2 and p53 in localized prostate adenocarcinoma incidentally dis 2covered at transurethral prostatectomy[J]．J Urol，2006，176：2701－2705．

[8]Cristi E，Perrone G，Todcano G，et al．Tumourproliferation，angiogen 2esis，and ploidy status in human colon cancer[J]．J Clin Pathol，2005，58(11)：1170－1174．

[9]Molnar B，Bocsi J，Karman J，et al．Immediate DNA ploidy analysisof gastrointestinal biopsies taken by endoscopy using a mechanicaldissociation device[J]．Anticancer Res，2003，23：655－660．

[10]鐘亮尹，曾智華．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫表型和分析DNA倍體對(duì)非霍奇金淋巴瘤患者的臨床價(jià)值 [J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2016，24(1)：94－97．

[11]胡艷芬，陳龍，謝賢和．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNA倍體數(shù)對(duì)鑒別良惡性腫瘤價(jià)值的Meta分析[J]．中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，44(2)：136－142．

[12]黃浩，陶義豐，黃玲莎．良惡性漿膜腔積液鑒別診斷研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2014，25(5)：61－63．

[13]賈留群，郭姝瑾，文富強(qiáng)，等．DNA異倍體檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液診斷價(jià)值的 Meta 分析[J]．西都醫(yī)學(xué)，2013，25(1)：16－19．

[14]左連富，主編．流式術(shù)與生物醫(yī)學(xué)[M]．沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1996．

[15]樊英李．流式細(xì)胞儀DNA倍體分析用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷[J]．癌癥進(jìn)展，2005，(3)：249－251．