DNA倍體分析與細胞學檢測對良惡性漿膜腔積液診斷的比較

何秋陽，鐘國梁，楊國順，張燦清，馬順高

(大理白族自治州人民醫院檢驗科，云南 大理671000)

漿膜腔積液是一種重要的病情標志，可分為漏出性、炎性及惡性三大類，臨床上漿膜腔積液的性質關乎病情的治療策略[1]。目前，利用顯微鏡檢查漿膜腔積液的脫落細胞是確診其性質重要手段，但該方法易受取材、檢驗者個人經驗等因素影響，導致其檢出率低。因此如何提高惡性漿膜腔積液的檢出率已成為當前亟待解決的問題。惡性腫瘤細胞DNA結構和含量的異常是其基本生物學特征之一，基于該特征，使得利用流式細胞術的DNA倍體分析技術檢測漿膜腔脫落細胞中的DNA含量成為明確其性質的又一重要途徑[2]。盡管DNA倍體分析在細胞鑒定領域的應用逐漸普及，但其對漿膜腔積液性質的診斷尚需進一步證實。本研究應用用流式細胞儀 (flowcytometer，FCM)和Meta分析系統對經臨床確診的95例良性及68例惡性漿膜腔積液樣本進行DNA倍體分析，同時結合傳統光學顯微鏡檢查，探討DNA倍體分析技術在良惡性漿膜腔積液診斷中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年 4月－2015年2月本院收治的漿膜腔積液患者163例，男94例，女69例，年齡 20～88 歲，平均年齡(55.7±15.8)歲。 全部病例均經臨床最終確診，良性漿膜腔積液95例，惡性漿膜腔積液68例。所有檢查均采用同一次抽取的胸水標。

1.2 儀器與試劑 采用美國BECKMAN COULTER公司的XL/MCL流式細胞儀及該公司生產的分析試劑。

1.3 方法

1.3.1 FCM檢測 取積液50ml離心后去上清液，加10ml PBS液洗滌2次后再調節細胞數至5×106/L，采用貝克曼公司提供的試劑破膜、溶血，加入PIN熒光染色劑與細胞結合15min。以正常人外周血淋巴細胞為對照。測定DI值。

1.3.2 細胞學檢測 胸水經離心沉淀后制片用劉氏染液染色，傳統光學顯微鏡下觀察脫落細胞形態。陽性為檢出異形細胞（疑為癌細胞）、檢出惡性細胞和檢出癌細胞；陰性為未檢出惡性細胞。

1.4 FCM 檢測 良、惡性判斷標準[3，4]：⑴正常二倍體細胞 DI值為 0.9～1.1，其余均為異倍體。 ⑵出現DNA的非整倍體(即發現異倍體)為惡性。⑶無明顯的非整倍體峰，但有一突出的四倍體峰和大于15%的S期細胞，并伴有G0/GI期CV值大于9%為惡性。⑷無明顯的非整倍體，但G0/GI期CV值增大，并伴有大于10～15%的S期和一個突出的四倍體峰，為可疑惡性。（見圖1和圖2）

圖1 DNA倍體分析（正常二倍體）

圖2 DNA倍體分析（異倍體）

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件包，對檢測結果進行卡方檢驗。

2 結果

本研究共收集163例漿膜腔積液樣本，其中惡性積液樣本68例，良性積液樣本95例。DNA倍體分析方法對惡性積液樣本檢測的靈敏度及特異性分別為75%、97.9%，陰性預測值及陽性預測值分別為 84.5%、96.2%；漿膜腔積液脫落細胞鏡檢對惡性積液樣本的靈敏度及特異性分別為42.6%、100%，陰性預測值及陽性預測值分別為70.9%、100%；而兩種方法的聯合靈敏度為95.6%，聯合特異性為1（見表1）。上述結果經卡方檢驗表明，DNA倍體分析的靈敏度及陰性預測值均顯著高于傳統的脫落細胞鏡檢（P＜0.01），且兩種方法的聯合靈敏度均高于單一檢測方法（P＜0.05），但兩種方法的特異性及陽性預測值無差異，且與聯合特異性也無顯著差異。

3 討論

傳統的顯微鏡檢查漿膜腔積液脫落細胞是鑒別良、惡性的金標準，但惡性腫瘤細胞檢出率低，同時有些細胞介于良惡性之間，很難做出診斷[5]。細胞學檢查能診斷出1/2～2/3的惡性漿膜腔積液[6]。但在惡性漿膜腔積液早期，僅有少量細胞為惡性時診斷較困難。DNA倍體是指一個個體細胞所含染色體組的數目，單倍體細胞是僅含一個染色體組的細胞，二倍體細胞是含二個染色體組的細胞，如果某個體細胞的染色體比二倍體多或少一條染色體，都稱為異倍體。由于測定細胞核DNA含量比計數核中染色體的數目容易，簡單方便，故倍體通常理解為細胞核DNA的含量，而相應的細胞稱為二倍體，多倍體和異倍體[7，8]。人體正常的體細胞均有較恒定的DNA二倍體含量，而在細胞癌變過程中將伴隨細胞DNA含量的異常改變，當細胞內DNA含量異常時，用FCM檢測可檢出DNA異倍體[9，10]。流式細胞術是20世紀70年代逐漸發展起來的一門新的細胞分析技術，集計算機技術、激光技術、電子技術、流體力學、細胞化學和細胞免疫學等多門技術為一體。近二十年來，通過流式細胞技術分析DNA逐漸成為鑒別漿膜腔積液良惡性的輔助方法[11，12]。本研究也顯示，流式細胞術進行漿膜腔積液DNA倍體分析敏感性67．6%，明顯高于傳統光學顯微鏡檢查39．7%，特異性93．7%，略低于顯微鏡檢查97．9%，和賈留群[13]等報道敏感度74%，特異度高0．94%基本相符，采用漿膜腔積液脫落細胞DNA倍體分析來判斷積液的良惡性存在一定的假陰性和假陽性[14]，本文檢測結果表明，其假陰性和假陽性分別為32．4%和6．3%，造成假陰性的主要原因是腫瘤細胞未脫落至漿膜腔；DNA異倍體檢測需要相當數量的DNA異常細胞，較小的染色體異常可能不能被流式細胞儀檢測到；非整倍體峰太小被整倍體峰掩蓋；某些腫瘤細胞DNA的丟失和復制平衡，導致腫瘤細胞凈DNA正常[15]；另外也與高分化的二倍體腫瘤有關；假陽性可能是與漿膜腔積液中存在大量的炎性細胞和多核細胞等有關。運用漿膜腔積液脫落細胞DNA倍體分析來判斷積液性質，可以提高陽性檢出率，適合于脫落細胞的良惡性質判斷篩查，兩種聯合有助于提高惡性漿膜腔積液診斷的敏感性和特異性，且可進行早期癌前診斷，對于了解腫瘤細胞的增殖情況及惡性程度和預后也有重要的臨床意義。

表1 DNA倍體分析及鏡檢方法對163例漿膜腔積液脫落細胞的檢測及統計結果

[1]問亞鋒，金恂，李軍．惡性胸腔積液中DNA倍體分析的診斷價值[J]．實驗與檢驗醫學，2009，27(5)：560－560．

[2]賈留群，郭姝瑾，萬春．DNA異倍體檢測對惡性胸腔積液診斷價值的 Meta 分析[J]．西部醫學，2013，25(1)：16－19．

[3]Joseph E，Fuhr JE，Anthory A，et al．Flow cytometry analysis of pul－monary fluids and cells for the detection of malignancies[J]．AM JPathol，1992，141(1)：218．

[4]逯海，陳勇，張斌．細胞DNA倍體分析在食管癌臨床診斷 和疾病程度及預后預測中的價值 [J]．中國醫藥，2017，12(9)：1379－1382．

[5]Tetsuo s．Differential diagnosisof pleural effusions[J]．JMAJ，2006，49(9)：315－319．

[6]Vladutin A，Brason F，Adler R．Differential diagnosisof pleuraleffusions[J]．CHEST，1981，79(3)：297－301．

[7]Abaza R，DiazLK Jr，Laskin，et al．Prognostic value of DNA ploidy，bcl－2 and p53 in localized prostate adenocarcinoma incidentally dis 2covered at transurethral prostatectomy[J]．J Urol，2006，176：2701－2705．

[8]Cristi E，Perrone G，Todcano G，et al．Tumourproliferation，angiogen 2esis，and ploidy status in human colon cancer[J]．J Clin Pathol，2005，58(11)：1170－1174．

[9]Molnar B，Bocsi J，Karman J，et al．Immediate DNA ploidy analysisof gastrointestinal biopsies taken by endoscopy using a mechanicaldissociation device[J]．Anticancer Res，2003，23：655－660．

[10]鐘亮尹，曾智華．流式細胞術檢測免疫表型和分析DNA倍體對非霍奇金淋巴瘤患者的臨床價值 [J]．中國實驗血液學雜志，2016，24(1)：94－97．

[11]胡艷芬，陳龍，謝賢和．流式細胞術檢測DNA倍體數對鑒別良惡性腫瘤價值的Meta分析[J]．中國醫科大學學報，2015，44(2)：136－142．

[12]黃浩，陶義豐，黃玲莎．良惡性漿膜腔積液鑒別診斷研究進展[J]．醫學檢驗與臨床，2014，25(5)：61－63．

[13]賈留群，郭姝瑾，文富強，等．DNA異倍體檢測對惡性胸腔積液診斷價值的 Meta 分析[J]．西都醫學，2013，25(1)：16－19．

[14]左連富，主編．流式術與生物醫學[M]．沈陽：遼寧科學技術出版社，1996．

[15]樊英李．流式細胞儀DNA倍體分析用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷[J]．癌癥進展，2005，(3)：249－251．