降鈣素原量子點熒光免疫層析檢測法的方法學評價

鐘陽青，陳銳，張偉龍，潘理想，陳杰，林燕珍

(東莞市塘廈醫院檢驗科，廣東 東莞 523722)

降鈣素原（PCT）是一種內源性非類固醇抗炎物質，是降鈣素的前體，在甲狀腺中合成，在細菌感染時誘導產生，目前被認為在調控細胞因子的網絡中發揮著舉足輕重的作用[1]。PCT是全身感染、局部感染及預后判斷的良好指標[2－4]。用于PCT檢測的方法主要有免疫層析法[5]免疫比濁法[6]、上轉熒光法、膠體金比色法、乳膠增強免疫比濁法、電化學發光法[7]和免疫色譜檢測法。量子點(Quantum dots，QDs)，屬于新型半導體納米材料，具有優良的光譜特征和光化學穩定性。與生物熒光染料相比，其激發譜線范圍寬、發射譜線窄、發光效率高、發光顏色可調、光穩定性好，十分適合作為熒光標記物[8]。本研究通過對量子點熒光免疫層析法的精密度、分析測量范圍、生物參考區間及與梅里埃miniVIDAS熒光免疫法的比對試驗來評價其方法學性能，現報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料 梅里埃miniVIDAS免疫熒光檢測系統（參比系統），深圳金準生物量子點熒光免疫檢測系統（實驗系統），配套的校準品、質控品，接近廠家聲明分析上、下限的新鮮血清標本，收集2017年5月至2017年6月東莞市塘廈醫院檢測的患者新鮮血清120例，其檢測結果分布廠家說明的整個分析測量范圍。

1.2 方法 精密度評價采用EP15－A3方案，即使用參比系統配套的兩個濃度水平的質控品在實驗系統上每天檢測一批，每批重復測試5次，連續測試5d，通過統計計算重復性精密度和期間精密度；分析測量范圍評價采用EP6－A2方案，即選擇接近說明書分析測量上限（H）和下限（L）的標本，按照5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L 的比例混合，上機檢測，每一份混合樣品檢測兩次，以理論值為縱坐標、實測值為橫坐標，計算斜率、截距和線性相關系數；生物參考區間驗證采用C28－A2方案，選取于體檢科體檢的健康個體血清20例，上機檢測，所有20例標本中有大于95%的標本檢測結果小于0.25ng/ml為可接受；對比實驗用新鮮血清2h內分別在參比系統和實驗系統上進行檢測。

1.4 儀器試劑 梅里埃公司miniVIDAS分析儀；深圳金準生物有限公司PCT測定試劑盒；所有儀器均使用配套試劑，嚴格按照廠家要求進行維護保養，各檢測系統實驗期間質控均在控。

1.5 統計方法 實驗數據收集完成后錄入excel表格，采用SPSS 19.0進行統計分析。以參比系統結果為準，以 0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml為臨界值，計算實驗系統的陽性符合率、陰性符合率、假陽性率、假陰性率、診斷符合率，率的比較使用χ2檢驗，P＜0.05為有統計學差異；通過Kappa分析法分析三種檢測方法的一致性，K值大于0.75為一致性較好，K 值在 0.4～0.75 之間表示一致性一般，kappa＜0.4 為一致性較差。

2 結果

2.1 精密度評價結果 在2.01ng/ml濃度水平時重復性精密度 CV為 4.96%，期間精密度 CV為6.81%， 在 20.13ng/ml濃度水平時重復性精密度CV為4.70%，期間精密度CV為9.68%。 見表1。

表1 精密度評價結果

2.2 分析測量范圍評價結果 采用EP6－A2文件的要求進行實驗及統計分析，低值標本測定均值為0.1327ng/ml，高值標本均值為 93.2917ng/ml，通過線性回歸分析后斜率 a=0.978， 截距 b=－0.741，線性相關系數 r=0.996， 斜率 a 在 0.97～1.03 之間，線性相關系數 r＞0.975， 檢測系統在 0.1327ng/ml～93.2917ng/ml濃度范圍內呈線性。

2.3 診斷效能評價結果 以參比系統為準分別取0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml為臨界值， 統計實驗系統的陽性符合率、陰性符合率、假陽性率、假陰性率、診斷符合率，結果見表2、表3。

2.4 生物參考區間驗證 選取的20份健康體檢者的血清標本PCT檢測結果均小于0.25ng/ml；

2.5 與參比系統結果一致性分析 當K值＞0.75時表示一致性較好，介于0.4～0.75之間時一致性一般，當K值＜0.4時表明兩種方法的一致性較差。以0.25ng/ml為臨界值時 K 值為 0.73， 以 0.5ng/ml為臨界值時K值為0.81，以2.0為臨界值時K值為0.95。

2.5 與參比系統結果的相關性分析 選取的120份標本濃度范圍在 0.05ng/ml到 59.88ng/ml之間，在2h內完成兩檢測系統的檢測。結果通過線性回歸分析得出斜率 a 為 0.865，截距 b 為 0.294，相關系數R2為0.982，相關性較好。

表2 不同臨界值下的檢測結果（例數）

表3 不同cut-off值下量子點免疫熒光層析法的診斷效能（%）

圖1 參比系統與實驗系統檢測結果相關性分析

3 討論

血清降鈣素原（PCT）是反應全身炎癥狀況的生物標志物，具有實時、便捷、敏感、特異等優點，隨著研究的深入、檢測技術的進步，大量研究表明以 0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml為臨界值其在 AECOPD、濃度血癥等的輔助診斷、預后判斷和指導抗生素使用方面有重要的意義[9－11]。因此對PCT的檢測結果準確度和靈敏度要求較高。

量子點(Quantum dots，QDs)，屬于新型半導體納米材料，具有優良的光譜特征和光化學穩定性。與生物熒光染料相比，其激發譜線范圍寬、發射譜線窄、發光效率高、發光顏色可調、光穩定性好，十分適合作為熒光標記物[8]。何國煒[12]等的研究表明量子點熒光免疫層析法檢測PCT的性能與Roche電化學發光系統的檢測性能有很好的相關性。余皓[13]等的研究也表明量子點技術與其它免疫定量檢測具有較好的可比性。

本研究采用EP15－A3文件[14]方案對量子點熒光免疫層析法（試驗系統）進行精密度評價，結果在 2.01ng/ml和 20.13ng/ml濃度時其重復性變異系數（CV）分別為 4.96%、4.70%，期間變異系數（CV）分別為6.81%，9.68%，廠家說明書給出批內CV＜15%，批間CV＜20%，驗證結果符合廠家說明，根據國家衛生與計生委員會臨床檢驗中心室間比對允許總誤差為30%，重復性CV小于1/4允許總誤差，期間精密度小于1/3允許總誤差，表明其精密度符合要求。分析測量范圍評價采用EP6－A2文件[15]方案進行，結果在廠家聲明的整個線性范圍內結果呈線性；選取的20例健康個體的血清標本其PCT檢測結果均小于 0.25ng/ml；

實驗系統與參比系統的檢測結果比較在以0.5ng/ml和 2.0ng/ml為臨界值時兩種方法的診斷符合率分別為90.83%、98.33%，一致性較好K值分別為 0.81 和 0.95，但是在以 0.25ng/ml為臨界值時一致性一般K值為0.73，存在著25%的假陽性率，但是其陽性符合率達98.333%，總的診斷符合率達86.67%，故符合臨床檢測的需要。

隨著檢測技術的進步和臨床研究的深入，PCT檢測在全身感染和局部感染的診斷和鑒別診斷、治療方案選擇、預后判斷等方面起重要作用[16]。本研究表明三種檢測系統間比較各有優劣，檢測結果兩兩比較相關性均較好，但是結果數值差異較大，因此實驗室檢測同一病人的標本需要固定檢測系統，或進行檢測系統之間的相關性轉換，保證科室結果的一致性。

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