肝素體外誘導血小板聚集的相關性研究

巫小莉 ，張玲 ，肖鴻岸 ，陳倩禮 ，周碧云

(1、廣州金域醫學檢驗中心，廣州51000；2、廣州中醫藥大學金沙洲醫院，廣州510168)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 Sysmex XN－1000全自動血液分析儀；配套試劑；校準物名稱：XN－CAL，批號：63130525、 質 控 物 批 號 ：63611101、63611102、63611103；廣州陽普科技醫療股份有限公司：2mg/ml EDTA－K2抗凝管：批號 161119；20IU/ml肝素鋰抗凝管： 批號：161010；3.8%枸櫞酸鈉抗凝管：批號：170119；奧林巴斯BX－43雙目顯微鏡；貝索企業：瑞氏－姬姆薩染液；

1.1.2 標本來源 新鮮血標本來自廣州中醫藥大學金沙洲醫院門診病人及健康體檢者。

1.2 方法

1.2.1 儀器的準備 按 《中華人民共和國衛生行業標準WS/T406－2012》臨床血液學檢驗常規項目校準操作要求進行校準。各項指標均達到國家行業標準。

1.2.2 質控 每天質控（高、中、低）數據均在±2SD范圍之內；

1.2.3 標本選取 本院近三個月內沒有用過肝素或其他抗凝治療的臨床標本共102例，其中82例用于EDTA－K2與肝素抗凝血的血小板計數比對；20例體檢標本用于不同濃度肝素的血小板計數及MPV的比對。同步進行涂片染色顯微鏡觀察。

1.2.4 實驗操作 每例同時抽血3管：2mg/ml EDTA－K22ml、20IU/ml肝素鋰管抽血 5ml、50IU/ml肝素鋰管抽血2ml，分別進行血小板計數，同步涂片觀察血小板分布情況。試驗于抽血后15min開始，兩小時內同步完成測試。

1.2.5 正常人的枸櫞酸鈉抗凝血2管，1000rpm離心5min，吸取富含血小板血漿（PRP），其中一管加入肝素，另一管不加肝素，混勻放置數分鐘后分別涂片染色，在鏡下觀察血小板分布情況。

西芳寺原是作為圣德太子別墅而建的寺院，于1339年重建為禪宗寺院，是日本最古老的庭園之一，也是日本枯山水庭園的開山之作，由日本枯山水鼻祖、禪學國師夢窗疏石設計建造而成，融合了禪宗中幽玄、素樸、自然、清靜等理念，已被列入世界文化遺產。日本的枯山水園林即由細沙碎石鋪地，表示“水”，一些疊放有致的石塊表示“山”，再添加苔蘚、草坪或其他自然元素，以此組成的縮微式園林景觀。西芳寺滿園生長有100多種苔蘚植物，庭園分為上、下兩段，上段庭園為枯山水園林，下段為平地的池泉回游式庭園。

1.2.6 統計學方法 數據處理采用 SPSS 13.0軟件包統計。

2 結果

2.1 82例EDTA－K2抗凝血與肝素鋰抗凝血的血小板計數，肝素鋰抗凝血的血小板數明顯低于EDTA－K2抗凝血的血小板數，有非常顯著性差異，P＜0.01。數據顯示，肝素鋰抗凝的血小板計數量的下降速度存在個體差異，不同個體的血小板出現不同的聚集狀，有簇狀、小簇狀、大簇狀，甚至成堆聚集。見圖1、表1。

表1 EDTA-K2抗凝血與肝素鋰抗凝血血小板計數比較

圖1 EDTA與不同濃度肝素抗凝血血小板鏡下分布圖（×1000）

2.2 20例不同濃度肝素抗凝血 20IU/ml肝素鋰管和50IU/ml肝素鋰管的血小板計數，高濃度肝素血小板數明顯減少，有非常顯著性差異（P＜0.01）。 見表2。

表2 不同濃度肝素抗凝血血小板計數比較

圖2 EDTA、肝素20IU與肝素50IU血小板計數比對（誤差條形圖：95%CI）

2.3 20例體檢標本中，肝素抗凝的MPV較EDTAK2抗凝大，50IU/ml肝素抗凝的MPV較20IU/ml肝素抗凝大，肝素濃度越高MPV越大，呈正相關，鏡下觀察血小板有腫脹現象，統計學有非常顯著性意義（P＜0.01）。 見表 3。

表3 EDTA-K2抗凝血與不同濃度肝素鋰抗凝血MPV比較

2.4 兩管富含血小板血漿（PRP），一管加入肝素，另一管不加肝素，混勻放置數分鐘后分別涂片染色，在鏡下觀察血小板分布情況，加入肝素的那一管血小板有聚集現象，見圖3。不加肝素的那管血小板呈星狀散在分布，見圖4。

圖3 PRP（有肝素）（×1000） 圖4 PRP（無肝素）（×1000）

3 討論

在體外，肝素可以誘導血小板聚集。表1結果顯示：同一條件下，EDTA－K2抗凝血與肝素抗凝血的血小板計數有非常顯著性意義，P＜0.001。圖1示顯微鏡下，肝素抗凝血涂片可見血小板聚集呈小簇狀、大簇狀或成堆分布，而EDTA－K2抗凝血的血小板呈星狀分布。表2結果顯示，高濃度肝素抗凝血的血小板計數降低幅度較低濃度肝素的明顯，兩者血小板計數有非常顯著性意義，P＜0.01；臨床亦有報導接受肝素治療的患者，嚴重出血與治療劑量之間有明顯關系，接受5mg和10mg劑量的患者出血事件的發生率均較高，接受最小劑量2.5mg的患者，出血發生率低于隨機接受華法林的患者(P=0.029)[11－14]，說明不論體外試驗或體內治療，均受肝素濃度的影響。

為了確定肝素有無誘導血小板聚集的作用，研究小組進行了補充實驗：采集正常人的枸櫞酸鈉抗凝血2管，1000rpm離心5min，吸取富含血小板血漿（PRP），其中一管加入肝素，混勻放置數分鐘后分別涂片染色，在鏡下觀察血小板分布情況，結果顯示，加入肝素后血小板有聚集現象，見圖3；不加肝素的血小板則呈散在的星狀分布，見圖4，結論：肝素可在體外誘導血小板聚集。而Williams等的研究表明普通肝素可以直接激活血小板，增加血小板的聚集力[17]，實驗結果也證實了這一點。

此外，實驗數據和在顯微鏡下觀察到的血小板聚集的情況顯示，即使同劑量的肝素抗凝血樣本在顯微鏡下觀察，有的血小板聚集成大簇狀，甚至聚集成堆，有的樣本則形成小簇狀聚集。數據方面也是一樣，有些變化很大，有些則沒太大的變化，可能是因為肝素帶有負電荷可以與各種血漿蛋白結合，不同水平的蛋白可導致肝素的不同效果差別[2－18]。

根據文獻描述，體內肝素誘導血小板聚集應屬于非免疫性結合，肝素與血小板第四因子（PF4）結合是目前普遍接受的可能原因。臨床上肝素誘導的血小板減少癥（HIT）分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型較常見，原因不明，是一種良性的非免疫反應，可能與肝素直接激活血小板相關。[10－13]。肝素體內發生的Ⅰ型反應與直接激活血小板相關，而肝素體外誘導血小板聚集，也是肝素直接激活血小板而發生，兩者之間是否存在關聯性值得探討。

英國血小板輸血指南中明確指出肝素引起的免疫性血小板減少癥是血小板輸注禁忌證，即真正的HIT是不能通過輸注血小板治療的，因其反饋機制會導致更嚴重的血栓栓塞并發癥[11]。假設肝素引起的免疫性血小板減少癥并不是真正的血小板減少，而是血小板發生聚集造成的假性減少，此時如果輸注血小板會加速血小板聚集，導致嚴重的微循環血栓栓塞。假設是否成立，需待進一步做相關實驗驗證。

血透患者維持性血液透析(Maintenance haemodialysis，MHD)由于需要反復高頻次的使用肝素，因此更具有發生HIT的風險[3]。更有文獻研究發現：約38%～78%HIT患者形成血栓，其中截肢10%，20%～30%的患者一個月內死亡[12]。血液透析過程與肝素體外誘導血小板聚集試驗具有相似性，體內肝素治療后引起血小板的一系列反應或許與肝素在體外能誘導血小板聚集有相關，問題值得進一步思考和研究。當然，體外試驗用的是普通肝素，而體內治療用的是低分子肝素，兩者作用不能相提并論，我們可以從中得到啟示。

實驗數據與大量的臨床資料說明，肝素在體外、體內均可誘導血小板聚集。通過體外實驗的啟示，有必要對肝素抗凝原理進行重新認識和探討。

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