HBV宮內垂直傳播與母體、胎兒HBeAg的關系及胎盤CD35表達的研究

劉彩麗，李嵐，王穎瑛，史雨玉

(安陽市婦幼保健院檢驗科，河南 安陽 455000)

慢性乙型肝炎是世界上最常見的傳染病之一，乙肝病毒的傳染性比引起艾滋病的HIV病毒強100倍。中國是乙型肝炎的高發地區，乙肝病毒的持續感染造成乙肝慢性化，繼發肝硬化，肝細胞癌。乙肝母嬰垂直傳播是重要的傳播方式之一，在未給予干預的情況下，HBV母嬰垂直傳播比例高達90%，包括宮內傳播、產時傳播以及產后傳播。宮內傳播與胎盤屏障受損或者通透性增強引起母血滲漏有關。產時傳播是母嬰傳播的主要途徑，在分娩過程中子宮收縮使胎盤絨毛破裂，母血進入胎兒循環，或者在胎兒經過產道時，吞咽含有HB-sAg的母血、羊水、陰道分泌物，導致感染。分娩過程中的感染以及產后傳播機制明確，可通過縮短分娩時間，人工喂養等方式干預，預防傳播。目前宮內傳播機制仍然是研究的熱點，也是有效阻斷垂直傳播的關鍵。國內的研究顯示，HBsAg高滴度，HBeAg陽性，HBV DNA高滴度，先兆早產是宮內傳播的危險因素[1，2]。本文探討宮內垂直傳播與胎兒HBeAg的關系及胎盤CD35表達水平，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月-2017年6月HBsAg陽性的孕婦121例為研究對象，根據新生兒臍血HBeAg結果分為HBeAg陽性組（58例）以及HBeAg陰性組（63例），另選擇HBsAg陰性孕婦分娩50例為對照組。納入標準：單胎，足月產，孕婦血清其他類型肝炎以及TTV均為陰性；無先兆早產、先兆流產、妊娠期高血壓、其他感染性疾病病史；肝腎功能無異常；孕期未接受免疫調節劑、抗病毒藥物、細胞毒性藥物、激素類藥物治療；未合并免疫系統疾病；胎兒發育正常。孕婦丈夫非HBV攜帶；孕婦年齡、孕次、產次、胎齡、分娩方式等一般資料匹配（P＞0.05）。見表1。本研究經過醫院醫學倫理委員會同意。

1.2 材料、儀器以及試劑 HBV血清學標志物ELISA試劑盒（上海雙贏生物科技有限公司）；人細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-6 ELISA試劑盒（北京同立海源生物科技有限公司）；HBV PCR熒光定量檢測試劑盒 （安徽達健醫學科技有限公司）。酶標儀，PCR擴增儀，37℃恒溫箱，Ependorff管，洗板機，微量加樣槍。1%鹽酸酒精溶液，各濃度酒精，二甲苯，石蠟，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠，鼠抗人CD35（北京愛博生生物技術有限公司），自配EDTA，DAB染色試劑盒，PBS液。切片機，恒溫箱，包埋紙盒，顯微鏡。

表1 三組一般資料比較

1.3 檢測項目及方法

1.3.1 標本采集以及檢測項目 產前采集孕婦靜脈血 4ml，4℃保存，6h 后離心，3000rpm，10min， 取上清，進行HBV血清學標志物檢測以及HBV DNA檢測。分娩時，無菌條件下采集新生兒臍靜脈血5ml。2ml用于檢測血清HBV標志物以及HBV DNA。定量檢測，余離心后取血清，分裝于EP管中，-70℃保存， 檢測 IL-2、IL-4、IL-6 以及 IFN-γ水平。胎盤娩出后，檢查無肉眼病理改變，生理鹽水清洗，分為4個象限，每個象限取1×1×2.0cm3大小中央帶全層，多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，待測胎盤CD35表達水平。

1.3.2 檢測方法 ⑴采用雙抗夾心酶聯免疫吸附法檢測血清HBV標記物。⑵采用實時熒光定量PCR方法檢測HBV DNA。⑶采用ELISA方法測定細胞因子IL-2、4、6以及IFN-γ。所有操作嚴格按照說明書進行。⑷胎盤CD35表達檢測：石蠟切片脫蠟，放入3%雙氧水-甲醛液中浸泡，消除內源性過氧化酶，PBS沖洗3次，每次2min，抗原修復，吸干液體后，每張切片加10%山羊血清適量，覆蓋組織，孵育10min，吸干液體，用PBS液1：50比例稀釋鼠抗人CD35，每張切片加適量一抗，覆蓋至，4℃過夜。PBS液沖洗3次，每次2min，吸干液體，加抗小鼠生物素化二抗，覆蓋組織，孵育10min，PBS沖洗3次，每次2min，吸干液體，加HRP標記的鏈親和素，覆蓋組織，孵育10min，PBS沖洗3次，每次2min；加DAB顯色液，室溫下2-15min顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，自來水沖洗，蘇木素復染1min；梯度酒精脫水，二甲苯透明化處理，封片，鏡檢。陽性：CD35表達在紅細胞、白細胞細胞膜，少量在細胞漿，棕黃色。

1.4 分析方法 統計121例新生兒發生宮內垂直感染的例數。胎兒宮內垂直感染判斷：臍血HBsAg陽性或者HBV DNA陽性，未接種乙肝疫苗前股靜脈血HBsAg陽性或HBV DNA陽性。分析孕婦HBeAg陽性、新生兒臍血HBeAg陽性、孕婦HBV DNA陽性者宮內感染率。比較三組臍血細胞因子水平。分析孕婦HBeAg與新生兒HBeAg陽性的相關性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 15.0統計學軟件分析數據，計數資料采用卡方檢驗，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用 F 檢驗或 t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新生兒宮內垂直傳播發生率 121例新生兒，16例發生宮內垂直傳播，感染率13.2%。發生宮內垂直傳播新生兒HBsAg均為陽性，HBeAg陽性14例，占87.5%；新生兒HBV DNA陽性4例，占25.0%。孕婦HBeAg陽性、新生兒HBeAg陽性以及孕婦HBV DNA陽性宮內感染率見表2。孕婦HBeAg陽性宮內感染率顯著高于陰性，新生兒HBeAg陽性者宮內感染率顯著高于陰性者，孕婦HBV DNA陽性者宮內感染率顯著高于陰性，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 孕婦HBeAg陽性、新生兒HBeAg陽性以及孕婦HBV DNA陽性宮內感染率

2.2三組臍血細胞因子水平比較 見表3。HBeAg陽性組新生兒臍血IL-2、INF-γ水平顯著下降，IL-4及IL-6顯著升高，與HBeAg陰性組及對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。HBeAg陰性組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 三組臍血細胞因子水平比較（pg/ml）

2.3 孕婦HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性的關系 見表4。孕婦65例HBeAg陽性，其中55例新生兒HBeAg陽性，相關性分析顯示兩者有顯著正相關的關系（r=0.791）。

表4 孕婦HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性的關系

2.4 胎盤組織CD35表達結果 共選擇HBsAg陽性的孕婦10例的胎盤檢測胎盤CD35，結果顯示，CD35主要表達在絨毛膜毛細血管的紅細胞膜，部分有核細胞有表達，而人胎盤滋養層、間質細胞中無CD35表達。提示CD35在血細胞上表達，而人胎盤各層組織中不表達。

3 討論

既往對于HBV宮內垂直傳播主要的研究是HBV通過胎盤途徑感染，孕婦血中病毒通過感染胎盤組織，從胎盤逐層最終傳遞給胎兒[3]。胎盤對胎兒有保護作用，在胎盤血管未發生破裂的情況下，病毒需要逐層感染胎盤的各層結構才能最終達到胎兒。大量的研究證實胎盤不同細胞病毒感染率自母體面至胎兒面呈逐漸下降的趨勢，但宮內傳播危險性卻逐漸升高，并且胎盤各層感染率、宮內感染率隨著妊娠周數增加而增加[4]。胎盤組織中 可 檢 測 到 HBsAg，HBeAg、HBV DNA 以 及HBcAg等標志物，證實HBV可感染胎盤并在滋養層細胞中復制，發生病理改變，最終導致胎兒感染[5]。HBV進入細胞后，HBsAg刺激細胞產生相應抗體，HBsAb的Fc片段可激活補體系統，形成抗原-抗體-補體復合物，如果胎盤組織有相應受體表達，則可結合復合物，使HBV逐層傳遞[6]。CD35是補體C3受體。HBV在胎盤上以HBsAg-抗HBs-補體C3形式存在。補體C3受體CD35是單鏈膜結合蛋白。在本次研究中，胎盤滋養層細胞以及間質細胞并不固有表達CD35，說明HBV在胎盤進行傳播時，可能并不通過HBsAg抗原-抗體-補體-補體受體途徑。

機體接觸病毒后是否感染以及感染后病情發展與免疫狀況密切相關，Th細胞是免疫應答的中心樞紐，Th1細胞與Th2細胞維持機體細胞免疫以及體液免疫的功能[7]。如果Th1或Th2細胞某一個亞群功能升高，一個受到抑制，導致機體免疫平衡的破壞。IL-2、INF-γ主要由Th1細胞分泌，主要誘導細胞免疫；IL-4及IL-6主要由Th2細胞分泌，誘導體液免疫。正常情況下機體Th1細胞與Th2細胞保持動態平衡，維持機體正常的免疫反應。而機體Th1/Th2的動態平衡是有效清除病毒以及病毒感染細胞的主要因素[8]。IL-2可刺激T細胞生長，促進B細胞增殖、分化，抗體產生，增強巨噬細胞等功能，抵御HBV感染。INF-γ可增強細胞免疫，增強巨噬細胞、中性粒細胞、活化NK細胞功能，可以在那轉錄后水平抑制HBV。IL-4調節體液免疫，對B細胞、巨噬細胞、T細胞有免疫調節作用，抑制Th1細胞因子表達。IL-6可誘導急性期蛋白合成，促進干細胞壞死，促進HBV感染，與肝癌、慢性肝炎的發生有關。在本次研究中，HBeAg陽性的新生兒IL-2、INF-γ水平下降，IL-4及IL-6水平升高，提示HBeAg可能抑制了胎兒Th1細胞分泌，促進了Th2細胞的分泌，機體細胞免疫受到抑制，促進HBV的感染[9]。分析結果也顯示HBeAg陽性的新生兒宮內垂直感染率高于陰性的新生兒。

HBeAg是HBV傳染性強弱的標志，既往的研究證實HBV DNA陽性，母體HBeAg陽性、新生兒HBeAg陽性是宮內垂直感染的高危因素[10-13]。本次的研究結果顯示，母體HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性具有正相關的關系，母體HBeAg陽性增加了新生兒HBeAg陽性率。HBeAg有結合與游離兩種形式，而結合狀態的HBeAg能自由通過胎盤，到達胎兒血液循環，這與胎盤組織上過表達HBeAg-抗HBe-補體復合物受體有關，在其作用下介導HBeAg通過胎盤，進入胎兒血液循環[14，15]。在本次研究中也證實這母體HBeAg陽性者，新生兒HBeAg陽性率也更高，并且母體HBeAg陽性者宮內垂直感染率更高。孕婦HBV DNA陽性者新生兒宮內垂直感染率也顯著高于陰性，與既往研究結果相似。有3例孕婦HBeAg陰性者而新生兒HBeAg陽性，可能與宮內感染后，新生兒自身產生相應抗原。

綜上所述，孕婦HBeAg陽性與新生兒HBeAg陽性顯著正相關的關系；新生兒HBeAg陽性者宮內感染率更高；HBV宮內垂直傳播的新生兒存在機體免疫失衡；人胎盤滋養層、間質細胞中無CD35表達，提示HBV在胎盤進行傳播時，可能并不通過HBsAg抗原-抗體-補體-補體受體途徑。

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