雞馬立克氏病疫苗雞胚免疫技術(shù)的應(yīng)用

馬巍陵　藺輝星　陳雷

摘 要：目的：通過不同的馬立克氏病（Mareks disease，MD）疫苗接種方法的比較，得出獲得最佳免疫效果的免疫方法。方法：選取孵化示范基地，孵化5組試驗(yàn)雞群，每組100羽，試驗(yàn)組分別采取出生1日齡免疫、18日齡雞胚免疫、出生免疫+17日齡二免、雞胚免疫+出生二免、空白對照，自60日齡起對試驗(yàn)雞群抽樣開展體液免疫檢測、細(xì)胞免疫檢測、病理檢測等試驗(yàn)室檢測工作。結(jié)果：與對照組相比，4個(gè)疫苗免疫組的血清抗體效價(jià)、IFN-γ、IL-4水平均顯著升高，同時(shí)MD的發(fā)病率顯著下降，其中，以18日齡雞胚免疫和雞胚免疫+出生免疫效果最為顯著。結(jié)論：雞胚免疫技術(shù)能有效提高雞馬立克氏病疫苗的免疫效果。

關(guān)鍵詞：雞；馬立克氏病；雞胚免疫

中圖分類號：S831.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180431003

雞馬立克病是由馬立克病病毒（Mareks disease virus，MDV）引起雞的一種傳染性腫瘤病，主要以各組織器官、神經(jīng)、皮膚及虹膜和性腺形成腫瘤和淋巴組織增生為特征[1]。由于MDV可通過空氣傳播，且感染的雞很快發(fā)病死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，MD是雞的重要疫病之一，受到了國內(nèi)外的重視。MD是目前已知的唯一可用疫苗成功預(yù)防的病毒性腫瘤疾病，無特效藥物治療，只能預(yù)防。但近年來發(fā)現(xiàn)，免疫雞群往往由于早期感染，導(dǎo)致免疫失敗，由于雞胚發(fā)育后期的組織學(xué)基礎(chǔ)研究[2] 和MD 雞胚免疫保護(hù)效果[3，4] 的研究都表明，雞胚在孵化后期已具備能夠產(chǎn)生一定程度的免疫應(yīng)答的組織基礎(chǔ)。因此，本文用雞胚免疫并結(jié)合常用的免疫方法對試驗(yàn)基地的雞群進(jìn)行試驗(yàn)，以期獲得最佳的雞馬立克病疫苗免疫方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 種蛋

該試驗(yàn)是以溧陽市南渡宏偉種禽養(yǎng)殖場、南渡仁福養(yǎng)雞場、南渡福興苗禽有限公司3家規(guī)模種禽養(yǎng)殖（孵化）場為示范基地，共孵化飼養(yǎng)五組試驗(yàn)雞群，每組100羽。

1.1.2 疫苗

試驗(yàn)組均免疫接種雞馬立克氏病Ⅰ+Ⅲ型二價(jià)活疫苗（CVI988+FC126株），按照0.2mL/枚的量接種。

1.2 雞胚孵化

試驗(yàn)所用的雞胚在孵化之前用甲醛熏蒸消毒30min，37.5～38.5℃孵化，濕度62%，每小時(shí)翻蛋1次，使用大型電氣自動(dòng)孵化器孵化。

1.3 試驗(yàn)分組及免疫方法

本項(xiàng)目是在示范基地，孵化飼養(yǎng)五組試驗(yàn)雞群，每組100羽。試驗(yàn)組分別采取出生1日齡免疫、18日齡雞胚免疫、出生免疫+17日齡二免、雞胚免疫+出生二免、空白對照。自60日齡起對試驗(yàn)雞群采血開展體液免疫檢測、細(xì)胞免疫檢測、病理檢測等試驗(yàn)室檢測工作。每組隨機(jī)抽取10羽雞，通過試驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)分析，制定合理的雞馬立克氏病免疫方法并推廣應(yīng)用。

1.3.1 第1組：出生1日齡免疫

剛出生的仔雞，進(jìn)行脛部外側(cè)肌肉注射稀釋好的雞馬立克氏病Ⅰ+Ⅲ型二價(jià)活疫苗0.2mL/枚。

1.3.2 第2組：18日齡雞胚免疫

孵育至18日齡的雞胚，用碘酊和酒精消毒雞卵鈍端的氣室，6號針頭在中央打孔，然后用5號注射器垂直進(jìn)針，刺入全部針長注射二價(jià)活疫苗疫苗0.2mL/枚，最后用石蠟封口，繼續(xù)常規(guī)孵化。

1.3.3 第3組：出生免疫+17日齡二免

將試驗(yàn)組的雞群在出生和17日齡時(shí)均進(jìn)行脛部外側(cè)肌肉注射二價(jià)活疫苗，0.2mL/羽。

1.3.4 第4組：雞胚免疫+出生二免

孵育18日齡后同上雞胚免疫，0.2mL/枚；出生一日齡時(shí)脛部外側(cè)肌肉進(jìn)行二免，0.2mL/羽。

1.3.5 第5組：未免疫的對照組

1.4 試驗(yàn)室檢測

1.4.1 間接ELISA法檢測雞馬立克氏病病毒血清抗體

采用商業(yè)化的MDV血清抗體間接ELISA檢測試劑盒，在酶標(biāo)板條微孔上預(yù)包純化的雞MDV的抗原。一定時(shí)間后，加入稀釋后的待檢血清，經(jīng)過溫育后，血清樣品中MDV的抗體與包被板上的抗原特異性的結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；再加入HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG酶標(biāo)二抗，與檢測板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物；在微孔中加入TMB底物液，經(jīng)酶催化形成藍(lán)色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450nm波長測定反應(yīng)孔中的吸光度A值。吸光度A值與樣品中雞馬立克氏病病毒抗體成正相關(guān)。

1.4.2 各試驗(yàn)組雞血清IFN-γ水平檢測

IFN-γ由1型輔助性T細(xì)胞（Th1細(xì)胞）分泌產(chǎn)生，主要參與細(xì)胞免疫。因此血清中的IFN-γ水平，可以間接反映試驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)胞免疫水平。

應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中雞γ干擾素（IFN-γ）水平。用純化的雞IFN-γ 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待檢血清，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IFN-γ呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清樣品中雞IFN-γ濃度。

1.4.3 各試驗(yàn)組雞血清IL-4水平檢測

IL-4由2型輔助性T細(xì)胞（Th2細(xì)胞）分泌產(chǎn)生，主要參與體液免疫。因此血清中的IL-4水平，可以間接反映試驗(yàn)動(dòng)物的體液免疫水平。

應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中雞白介素4（IL-4）水平。用純化的雞IL-4抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待檢血清，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IFN-γ呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清樣品中雞IL-4濃度。

1.4.4 各試驗(yàn)組雞發(fā)病率統(tǒng)計(jì)

觀察并統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組患有如下典型癥狀的病雞的數(shù)量。如病雞一側(cè)腿發(fā)生不全或完全麻痹，站立不穩(wěn)，兩腿前后伸展，呈“劈叉”姿勢。或精神萎頓，食欲減退，羽毛松亂，雞冠蒼白、皺縮，有的雞冠呈黑紫色，黃白色或黃綠色下痢，迅速消瘦，胸骨似刀鋒，觸診腹部能摸到硬塊。病雞脫水、昏迷，最后死亡。對疑似患病雞進(jìn)行病原PCR檢測，以確定疾病是由MDV引起的。并采取患病雞的肝等組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 MDV血清抗體的檢測

間接ELISA法檢測結(jié)果表明（圖1），雞雞胚免疫+出生二免試驗(yàn)組的雞血清抗體陽性率最高，可達(dá)95%，顯著高于其他試驗(yàn)組。18日齡雞胚免疫試驗(yàn)組的雞血清MDV抗體陽性率（88%）顯著高于出生1日齡免疫試驗(yàn)組（73%），同時(shí)也高于出生免疫+17日齡二免試驗(yàn)組（82%）。證實(shí)雞馬立克氏病病毒疫苗18日齡雞胚免疫可以誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生高水平的血清抗體，有效預(yù)防雞MDV的感染。

2.2 血清IFN-γ水平的檢測結(jié)果

雙抗體夾心法測定結(jié)果表明（圖2），雞雞胚免疫+出生二免試驗(yàn)組的雞血清IFN-γ水平最高，可達(dá)480 pg/mL，顯著高于其他試驗(yàn)組。18日齡雞胚免疫試驗(yàn)組的雞血清IFN-γ水平（445 pg/mL）顯著高于出生1日齡免疫試驗(yàn)組（326 pg/mL），同時(shí)也高于出生免疫+17日齡二免試驗(yàn)組（383 pg/mL）。證實(shí)雞馬立克氏病病毒疫苗18日齡雞胚免疫可以誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生高水平的細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效預(yù)防雞馬立克氏病病毒的感染。

2.3 血清IL-4水平的檢測結(jié)果

雙抗體夾心法測定結(jié)果表明（圖3），雞雞胚免疫+出生二免試驗(yàn)組的雞血清IL-4水平最高，可達(dá)168pg/mL，顯著高于其他試驗(yàn)組。18日齡雞胚免疫試驗(yàn)組的雞血清IL-4水平（134pg/mL）顯著高于出生1日齡免疫試驗(yàn)組（115pg/mL），同時(shí)也高于出生免疫+17日齡二免試驗(yàn)組（125pg/mL）。證實(shí)雞馬立克氏病病毒疫苗18日齡雞胚免疫可以誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生高水平的體液免疫反應(yīng)，有效預(yù)防雞馬立克氏病病毒的感染。

3.4 雞群MD發(fā)病率的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

觀察及統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（表1），未免疫的空白對照組有22%的雞感染MDV并發(fā)病，而進(jìn)行疫苗免疫的試驗(yàn)組，MDV發(fā)病率顯著降低。其中，雞胚免疫+出生二免試驗(yàn)組的發(fā)病率最低，MDV發(fā)病率僅2%，免疫保護(hù)效果最好。

3 討論

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，4個(gè)MD疫苗免疫組都顯著提高了雞血液中的抗體效價(jià)、IFN-γ、IL-4的水平，對雞的免疫應(yīng)答產(chǎn)生了很好的作用，且都顯著降低了MD的發(fā)病率。其中，試驗(yàn)組雞胚免疫+出生二免在提高機(jī)體對MDV的免疫和降低MD的發(fā)病率都起到了最好的免疫效果，其次是18日齡雞胚免疫組。說明雞胚免疫能夠有效地提高M(jìn)D疫苗的免疫效果。

參考文獻(xiàn)

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