人參皂苷Rb1通過減輕線粒體損傷對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用

程斌，楊峰，李鋒濤，林磊，薛建利，吳昊，葉勁濤

1.西安交通大學醫學院第二附屬醫院，陜西西安市710004；2.華縣人民醫院，陜西渭南市714100；3.漢中市中心醫院，陜西漢中市723000

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCII)指脊髓經歷一段時間的缺血后，血液再灌注后，神經功能不僅不能得到改善，反而出現神經功能受損加重的現象[1-2]。多種原因可以導致SCII的發生，如脊柱創傷、血管外科手術等。脊髓組織屬于神經組織，到目前為止，大多數研究仍認為神經組織缺血再灌注損傷是一種沒有有效治療方法的疾病。目前一般的處理方法為一旦發現SCII，立即予大劑量甲基強的松龍、神經營養藥物等治療，可以促進已受損的脊髓功能恢復，預防損傷進一步加重[3]。

人參皂苷Rb1是人參皂苷最主要的活性成分之一[4]，具有抗氧化、抗細胞凋亡、提高免疫力、減少細胞腫脹等作用。已有研究顯示，人參皂苷Rb1能明顯減輕腎、腦等臟器缺血再灌注損傷[5]，但在SCII方面報道較少。本實驗旨在觀察人參皂苷Rb1對于SCII后神經細胞線粒體損傷的影響，為今后治療脊髓缺血再灌注損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗動物

成年健康清潔級Sprague-Dawley大鼠134只，體質量(213±15)g，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心。

1.1.2 分組

將實驗動物隨機分為三組。假手術組(n=12)同其他實驗組一樣接受麻醉、介入操作，但不誘導脊髓缺血。SCII組(n=12)采用Fogarty導管阻斷胸主動脈血流，同時通過放血法降低血壓，造成大鼠脊髓缺血，缺血10 min后撤去導管，開始再灌注過程，再灌注48 h后處死大鼠。人參皂甙Rb1藥物組(藥物組，n=48)造模方法同SCII，脊髓缺血前30 min腹腔注射人參皂甙Rb1 10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，每個劑量組12只，術后每天腹腔注射相同劑量的人參皂甙Rb1。

1.2 主要儀器及試劑

丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測試盒：南京建成生物工程研究所。動物硬組織活性線粒體分離試劑盒、細胞色素C氧化酶(cytochrome Coxidase,COX)活性測定試劑盒：上海杰美基因醫藥科技有限公司。多聚甲醛：天津化學試劑廠。人參皂甙Rb1粉劑：中國藥品生物制品檢定所。

1.3 模型建立

實驗動物術前禁食一夜。3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，保持自主呼吸。肛溫探頭置入肛門，動物置于恒溫毯上，保持大鼠體溫維持37.1～37.5℃。取頸正中切口，顯露左側頸總動脈，置入PE50導管并連接放血裝置及監護儀，監測近端動脈壓及心率。在大鼠尾中段上1/3位置顯露尾動脈，置入PE50導管并連接監護儀，監測遠端動脈壓。左側腹股溝切口，顯露左側股動脈，遠端結扎后輕微牽拉，近端剪一切口，用注射器抽取生理鹽水0.05 ml，將Fogarty導管經股動脈置入到胸主動脈高度。全部導管置入結束后，立即給予肝素鈉200 U。將注射器內的生理鹽水0.05 ml推入，避免球囊松弛，同時立即打開放血裝置放血，在1 min內將近端平均動脈壓緩慢降至45 mmHg，并記錄血壓及放血量。脊髓缺血10 min后，松開球囊，立即勻速回輸放血裝置內的血液，回輸時間亦控制在1 min左右。術后監測血壓10 min后取出動脈插管，結扎動脈，皮下注射硫酸魚精蛋白4 mg。將動物放置于25～30℃保溫箱內，等待動物蘇醒后放回飼養籠中。

1.4 大鼠后肢神經運動功能評分

分別在脊髓缺血再灌注或藥物干預48 h后，采用ΒΒΒ評分，對各組大鼠后肢神經運動功能進行評分。評分人員為未參加本組實驗而熟悉評分標準人員。

1.5 標本采集

動物于脊髓缺血再灌注或藥物干預48 h后，心臟采血、處死。大鼠3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，心臟采血3 ml，室溫放置2 h后，1000 r/min離心10 min取血清，置于-20℃冰箱保存。之后升主動脈插管，并剪開右心房，快速灌注生理鹽水250 ml沖洗后，4%多聚甲醛繼續灌注至右心房流出清亮多聚甲醛、尸體僵硬。立即取出腰段脊髓組織1 cm作為標本，將其放入4℃4%多聚甲醛中固定24 h，自來水浸洗24 h，石蠟包埋，于L3節段2 mm范圍內連續切片，厚10μm。其余部分標本用于血清SOD、MDA、COX的檢測。

1.6 血清及脊髓組織中SOD活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，嚴格按照活性測試盒說明書進行檢測。

1.7 血清及脊髓組織中MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，嚴格按照測試盒說明書進行檢測。

1.8 脊髓組織中COX活性測定

1.8.1 脊髓組織線粒體的提取及其蛋白含量測定

準確稱取脊髓組織的質量，冰上操作，加入適量清洗液清洗后切碎，嚴格按照動物硬組織活性線粒體分離試劑盒說明書操作。

線粒體懸液采用考馬斯亮蘭法測定其線粒體蛋白含量，嚴格按照試劑盒說明測定。

1.8.2 COX活性測定

嚴格按照COX活性測定試劑盒說明書進行檢測。

1.9 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統計。計量資料采用(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析進行檢驗。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結果

實驗過程中意外死亡6只，其中SCII組4只，藥物組2只。分別在相同條件下予以補充。

2.1 ΒΒΒ評分

與假手術組比較，SCII組和藥物組ΒΒΒ評分均下降(P＜0.05)。藥物組 ΒΒΒ 評分均高于 SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，ΒΒΒ評分也相應增高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

2.2 血清及脊髓組織中SOD活性

與假手術組比較，SCII組和藥物組血清及脊髓SOD活性下降(P＜0.05)。藥物組SOD活性均高于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，SOD活性也相應增高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

2.3 血清及脊髓組織中MDA含量

與假手術組比較，SCII組和藥物組血清及脊髓MDA含量上升(P＜0.05)。藥物組MDA含量均低于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，MDA含量相應降低，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

2.4 脊髓組織中COX活性

與假手術組比較，SCII組和藥物組脊髓COX活性下降(P＜0.05)。藥物組COX活性均高于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，COX活性也相應升高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

3 討論

線粒體通過能量供給、細胞內的鈣平衡、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成、促凋亡蛋白釋放的機制促進凋亡，是細胞死亡的中樞性調節因子。主要的線粒體元件包括線粒體外膜及內膜，呼吸鏈(復合體Ⅰ～Ⅳ)以及復合體Ⅴ——COX。線粒體膜電位梯度在ATP合成及線粒體鈣平衡維持中起重要作用。細胞色素C松散結合在線粒體內膜的外表面。超氧自由基是電子傳遞鏈中復合物Ⅰ的黃素復合體或者復合體Ⅲ的泛半醌的自氧化作用中氧化磷酸化的副產物[6]。

缺血再灌注損傷可以導致線粒體損害。整個過程可以被認為是階段性的。早期階段由于缺乏作為電子最終接受體的氧，以及電子傳遞鏈的減少而導致呼吸功能改變，這些改變在中期階段仍可逆[7]。中期階段線粒體功能進一步改變，包括細胞色素C的釋放，以及線粒體通透性轉換孔的可逆性開發。在該階段已開始為不可逆的線粒體元件損害及細胞死亡提供了條件[8]。

表1 三組各指標比較

氧化應激在缺血再灌注損傷的作用已被確定。ROS在缺氧過程中可被看做是一種信號分子，也對細胞內元件造成直接損害。線粒體源性ROS可以損害一個或多個呼吸鏈元件，并加速超氧化物的形成，線粒體是細胞損壞后ROS的主要來源[9]。微量滲析檢測顯示，大腦皮質自由基產物在再灌注過程中升高[10]。

在哺乳動物細胞中，細胞內的自由鈣濃度只有細胞外的1/1000。鈣離子通常通過電壓門控或受體門控鈣離子通道進入細胞，然后與鈣結合蛋白結合，進入鈣儲備細胞器，再被鈣泵和離子交換體清除。線粒體蓄積鈣的能力很強。當細胞內鈣維持在生理穩態時，它并不儲備過多的鈣；但是，當細胞內鈣超過0.5 μmol/L時(鈣超載)，線粒體會將多余的鈣儲存起來[11]。研究顯示，缺血再灌注損傷可以使細胞內鈣濃度從0.1μmol/L快速升至30～60μmol/L，甚至更高。在大鼠腦組織缺氧/復氧實驗中發現，鈣離子進入線粒體基質，并通過阻斷線粒體的鈣離子傳遞系統介導線粒體損傷[12]。線粒體鈣負荷動力學研究顯示[13]，在低氧低糖環境下，大鼠CA1錐體神經細胞在缺氧時和缺氧后，自由基產生與線粒體鈣蓄積有關。

線粒體通透性轉換孔可以開放，允許所有離子及一些小分子通過。該孔的開放可以引起H+電位梯度崩潰以及ATP產物減少。該孔開放的附加效應是鈣離子釋放及氧化磷酸化的解偶聯，并引起ROS產物的爆發式產生。

線粒體通透性轉換孔的結構改變可以使線粒體對存在于線粒體內的許多促凋亡蛋白的通透性發生變化。已有實驗觀測到，在缺血再灌注損傷早期可見核轉錄因子及谷草轉氨酶的釋放。在腦組織缺血、局部缺血等條件下，亦可觀測到細胞色素C從線粒體到胞漿的再分布[14-15]。

在中樞神經系統缺血損傷中有氧化應激機制參與[16-17]。實際上，脂質過氧化物、過氧化氫等在損傷急性期已經升高。氧化應激是細胞內氧化物與抗氧化物之間的平衡被打破形成的，對組織有損害作用，可能是造成神經細胞損傷的原因之一。神經組織富含不飽和脂肪酸，對自由基誘導的脂質過氧化作用非常敏感，而此時抗氧化酶如過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等的含量很低[18]。同時，氧化應激還可以損傷線粒體功能[19]。

SOD是廣泛分布于各種生物體內的重要的抗氧化酶，是生物體內清除自由基的首要物質[20]，是生物體抗氧化能力的首選觀測指標。所以，諸多學者在缺血再灌注損傷試驗中使用SOD活性作為氧化應激損害程度的直觀指標[21]。MDA可以由乙醛和甲酸乙酯縮合生成。在生物體內，自由基的脂質過氧化作用終產物即為MDA，可以引起許多生物大分子的交聯，具有細胞毒性。MDA也是缺血再灌注損傷過程中氧化應激損害的一個重要監測指標，廣泛應用于此類實驗[22]。SOD通過催化O2-歧化反應，發揮抗氧自由基的作用，增強H2O2濃度的調節功能，保護組織細胞。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，兩者是反映脂質過氧化反應程度的重要指標，結果分析有助于準確掌握脊髓損傷程度。

COX由13個亞基組成，是呼吸鏈末端成員及其限速酶。其基因有線粒體編碼部分(3個亞基：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及細胞核編碼部分(10個亞基：Ⅳ、Ⅴa、Ⅴb、Ⅵa、Ⅵb、Ⅵc、Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc、Ⅷ)。核基因編碼的組織特異性亞基與不同組織的能量需求有關。ATP與ADP的比例可以調節COX的活性。ATP作為一種變構抑制物，具有第二種呼吸調控機制，以對抗第一種呼吸調控機制。ATP抑制COX的變構提示，可以通過信號傳遞途徑來對其亞基進行可逆性的磷酸化，從而調節COX的活性[23]。COX可以通過其亞基的磷酸化來調控其活性，亞基Ⅰ第304位酪氨酸的磷酸化可以導致COX活性的明顯降低[24]。COX的Ⅴa亞基與3,5-二碘甲狀腺氨酸結合、內源性NO或脂質過氧化物的生成，可以影響ATP對于COX的變構抑制作用，但這種影響在應激條件下很快被消除。

在缺氧條件下，線粒體編碼的COX亞基Ⅰ、Ⅱ及細胞核編碼的亞基Ⅳ、Ⅴb的mRNA出現相應的表達下調，這被認為與線粒體轉錄因子A的減少有關。另外，酶構成及活性的變化伴隨著細胞內ATP濃度的變化。COX的Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ亞基在缺血再灌注損傷中特異性磷酸化可以導致COX的功能受損。研究顯示，在缺血再灌注損傷中，亞基Ⅰ、Ⅴ明顯下降，通過缺血預處理僅能部分緩解這種趨勢[25]。COX可以作為缺血再灌注過程中線粒體損傷的一個重要標志。

人參皂苷Rb1是人參中達瑪烷型三萜皂苷類化合物，具有多種生物活性，對人參皂苷Rb1代謝產物的分析已有報道，在大鼠尿液、糞便、胃和大腸中共檢出14種代謝產物[26]。通過靜脈注射藥物后，尿液中排出主要為原型藥物，也包含部分代謝產物。血液中藥物達峰時間約為1.02 h。通過口服給藥生物利用度低，進入血液的原型藥物較少，在此基礎上發生的水解、結合、氧化和異構化等代謝反應也微乎其微。口服給藥后尿液中檢測到的代謝產物多為進入體內的胃腸道菌群代謝產物，其中水解產物居多，形成多個脫糖的代謝產物，在尿液中，水解代謝產物的量高于原型藥物。本實驗中選用腹腔注射藥物，一方面保證血藥濃度，另一方面保證足夠藥物在肝臟中進行代謝反應。有人使用1200 mg/kg口服藥物濃度進行試驗，得出結果血藥濃度1～20.0 mg/L范圍內線性關系良好，之后上升趨勢減緩[27]。考慮腹腔吸收藥物較口服生物利用率高，但仍有部分損失，所以實驗組中20 mg/kg組未達最好效果。40 mg/kg組扣除固定損失部分后可能已達到血藥濃度上限，同理80 mg/kg組也達上限，所以40 mg/kg組與80 mg/kg組從各方面評價效果差距不大。

本實驗結果顯示，單純的大鼠脊髓缺血再灌注損傷可以使脊髓組織的COX活性明顯降低，血清及脊髓組織的SOD活性明顯降低，MDA含量升高；說明大鼠脊髓缺血再灌注損傷即會引起明顯的線粒體損傷及氧化應激。藥物組各劑量組值雖都較假手術組降低，但與SCII組相比，COX活性和SOD含量升高，MDA含量下降，且這種改變隨藥物劑量增大而愈加明顯，但在干預劑量大于40 mg/kg后這種趨勢不再明顯。這證實人參皂甙Rb1干預可以促使大鼠COX活性提高，SOD活性提高，MDA生成減少，且這種變化趨勢在干預劑量小于40 mg/kg時呈劑量依賴。

[1]Crawford ES,Rubio PA.Reappraisal of adjuncts to avoid ischemia in the treatment of aneurysms of descending thoracic aorta[J].JThorac Cardiovasc Surg,1973,66(5):693-704.

[2]Wynn MM,Acher CW.A modern theory of spinal cord ischemia/injury in thoracoabdominal aortic surgery and its implications for prevention of paralysis[J].JCardiothorac Vasc Anesth,2014,28(4):1088-1099.

[3]夏炳江,肖魯偉.脊髓慢性壓迫減壓后缺血再灌注損傷研究進展[J].中華中醫藥學刊,2017,35(4):998-1001.

[4]王國麗,李曉嬌,張力娜,等.人參皂苷Rb1、Rg1對中樞神經系統作用及相關機制的研究進展[J].上海中醫藥雜志,2017,51(3):92-95.

[5]林少濱.人參皂苷Rb1后處理對大鼠全腦缺血再灌注后認知功能的影響[J].海峽藥學,2017,29(7):15-17.

[6]Murphy AN,Fiskum G,Βeal MF.Mitochondria in neurodegeneration:bioenergetic function in cell life and death[J].J CerebΒlood Flow Metab,1999,19(3):231-245.

[7]D'Herde K,De PrestΒ,Mussche S,et al.Ultrastructural localization of cytochrome C in apoptosis demonstrates mitochondrial heterogeneity[J].Cell Death Differ,2000,7(4):331-337.

[8]Cao XH,Zhao SS,Liu DY,et al.ROS-Ca(2+)is associated with mitochondria permeability transition pore involved in surfactin-induced MCF-7 cellsapoptosis[J].ChemΒiol Interact,2011,190(1):16-27.

[9]Wang Y,Jiang YF,Huang QF,et al.Neuroprotective effects of salvianolic acidΒagainst oxygen-glucose deprivation/reperfusion damage in primary rat cortical neurons[J].Chin Med J(Engl),2010,123(24):3612-3619.

[10]Ye R,Zhang X,Kong X,et al.Ginsenoside Rd attenuates mitochondrial dysfunction and sequential apoptosis after transient focal ischemia[J].Neuroscience,2011,178(3):169.

[11]Toescu EC,Gardner JM,Petersen OH.Mitochondrial Ca2+uptake at submicromolar[Ca2+]i in permeabilised pancreatic acinar cells[J].ΒiochemΒiophys Res Commun,1993,192(2):854-859.

[12]Schild L,Huppelsberg J,Kahlert S,et al.Βrain mitochondria are primed by moderate Ca2+rise upon hypoxia/reoxygenation for functional breakdown and morphological disintegration[J].JΒiol Chem,2003,278(28):25454-25460.

[13]Frantseva MV,Carlen PL,Perez Velazquez JL.Dynamicsof intracellular calcium and free radical production during ischemia in pyramidal neurons[J].Free RadicalΒiology & Medicine,2001,31(10):1216-1227.

[14]Zhao Q,Zhang C,Wang X,et al.(S)-ZJM-289,a nitric oxide-releasing derivative of 3-N-butylphthalide,protectsagainst ischemic neuronal injury by attenuating mitochondrial dysfunction and associated cell death[J].Neurochem Int,2012,60(2):134-144.

[15]Zhang H,Li Q,Li Z,et al.The protection ofΒcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusion in vitro[J].Neurosci Res,2008,62(2):140-146.

[16]余智,于民,顧蘇兵,等.[Gly14]-Humanin對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激及神經細胞凋亡的影響[J].預防醫學,2018,30(1):55-58.

[17]李春雷,黃川鋒,張峰.醒腦靜注射液聯合醒腦竅法對腦缺血再灌注大鼠血清及腦組織炎癥因子水平的影響[J].中國臨床藥理學雜志,2016,32(20):1873-1877.

[18]Nanetti L,Taffi R,Vignini A,et al.Reactive oxygen species plasmatic levelsin ischemic stroke[J].Mol CellΒiochem,2007,303(1-2):19-25.

[19]Galpern WR,Cudkowicz ME.Coenzyme Q treatment of neurodegenerative diseases of aging [J].Mitochondrion,2007,7(Suppl):S146-S153.

[20]Udipi K,Ornberg RL,Thurmond KN,et al.Modification of inflammatory response to implanted biomedical materials in vivo by surface bound superoxide dismutase mimics[J].JΒiomed Mater Res,2000,51(4):549-560.

[21]孔令恒,陳玉龍,孫娜,等.抑制CaMKII減輕線粒體氧化應激可改善離體心臟缺血再灌注損傷[J].南方醫科大學學報,2018,38(2):181-186.

[22]方華,李華鳳,張偉晶,等.腹主動脈灌注瑞芬太尼聚己內酯減輕脊髓缺血再灌注損傷的實驗研究[J].生物醫學工程學雜志,2016,33(4):735-740.

[23]Vogt S,Troitzsch D,Abdul-Khaliq H,et al.Heat stress attenuates ATP-depletion and pH-decrease during cardioplegic arrest[J].J Surg Res,2007,139(2):176-181.

[24]Lee I,Salomon AR,Ficarro S,et al.cAMP-dependent tyrosine phosphorylation of subunit Iinhibits cytochrome c oxidase activity[J].JΒiol Chem,2005,280(7):6094-6100.

[25]Yu Q,Nguyen T,Ogbi M,et al.Differential loss of cytochrome-C oxidase subunits in ischemia-reperfusion injury:exacerbation of COI subunit loss by PKC-epsilon inhibition[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2008,294(6):H2637-H2645.

[26]楊柳,許舜軍,曾星,等.人參皂苷Rb_1在大鼠體內的藥物代謝研究[J].高等學校化學學報,2006,27(6):1042-1044.

[27]胡錦芳,溫金華,蔣麗華.復方血栓通片中人參皂苷Rb1與Rg1在大鼠體內的藥代動力學研究[J].南昌大學學報(醫學版),2011,51(11):6-9.