脾氣虛模型大鼠心肌GLUT4表達變化及四君子丸對其調控作用的研究*

宋 君，王艷杰（遼寧中醫藥大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧沈陽110847）

有學者認為，脾氣虛證涉及現代醫學包括消化、免疫、循環、內分泌及自主神經等多系統功能的紊亂和失調。脾的主要功能是運化，脾將飲食水谷轉化為精微物質，并輸送至全身，濡養各個器官及組織。因此，脾氣虛證發生機制的最基本內涵所在是脾失運化，主要體現在物質能量轉化及利用的環節上，即脾氣虛弱時，脾的運化功能失常，將導致能量代謝障礙[1]。

葡萄糖是心肌的主要能量來源，心肌能量代謝的主要底物之一。葡萄糖通過細胞膜進入細胞內是心肌細胞利用葡萄糖的第一步，是細胞利用葡萄糖的主要限速步驟。葡萄糖要依靠細胞膜上的葡萄糖轉運體（GLUTs）才能進入細胞內，葡萄糖轉運體4型（GLUT4）是心肌細胞最主要的GLUTs，在心肌葡萄糖的跨膜轉運中起著決定性作用。基于GLUT4在心肌細胞利用葡萄糖過程中的重要作用，脾氣虛證是否可以影響GLUT4的表達，從而導致葡萄糖轉運異常呢？

為此，本實驗將通過建立脾氣虛大鼠模型，并用四君子丸對其進行治療，采用分子生物學實驗方法檢測脾氣虛大鼠心肌細胞GLUT4 mRNA及其蛋白的表達，并探討脾氣虛時GLUT4的表達變化及四君子丸對其干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 苯甲基磺酰氟（PMSF，博士德）；RIPA組織細胞裂解液（Solarbio）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；化學發光底物（Thermo）；一抗稀釋液（Beyotime）；一抗（北京博奧森生物技術有限公司）；二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；熒光定量 PCR（qPCR）試劑盒（Takara）。

1.1.2 藥品 四君子丸（湖北廣仁藥業有限公司）。將四君子丸研磨成粉末，按照四君子丸粉末與蒸餾水1∶1.5（W∶V）的比例配制成懸濁液，以備后用。

1.1.3 儀器 Vevo2100型高分辨率小動物專用超聲影像系統（Visualsonics）；7500 qPCR 儀（Applied Biosys?tems）；Biospec?Nano型紫外可見分光光度計（島津公司）；冷凍離心機（Thermo）；Trans?Blot SD 半干轉印、垂直板電泳裝置（Bio?Rad）；FA2004精密天平（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.1.4 實驗動物 雄性SD大鼠24只，體重（200±10）g，由本溪實驗動物中心提供，許可證號SCXK（遼）?2010?0001。動物購回后適應性喂養1周。

1.2 方法

1.2.1 分組 將SD大鼠隨機分為對照組、模型組及四君子丸治療組，每組8只。模型組及四君子丸治療組采用飲食不節及力竭游泳法造模，即先飽食1 d，再禁食2 d，自由飲水，每天于35～37℃水溫下游泳至力竭，3 d為1個循環，連續5個循環。在此期間，對照組不施加刺激因素，正常飼養。模型組大鼠出現食少、神疲乏力、消瘦、毛色枯槁無光澤及便軟或溏等表現時，證明脾氣虛證模型建立成功。四君子丸治療組根據體表面積進行換算，采用四君子丸懸濁液0.648 g/100 g進行灌胃治療；對照組和模型組用等量蒸餾水進行灌胃，灌胃治療14 d。

1.2.2 心功能檢查 采用高分辨率小動物專用超聲影像系統為大鼠做彩色超聲多普勒心動圖，測定各組大鼠的左心室射血分數（EF）、短軸縮短率（FS）。EF、FS的數值均經計算機處理后獲得。

1.2.3 RNA提取 將各組大鼠心臟組織放入高壓過的EP管中。每孔加入0.5 mL Trizol裂解液，多次搖晃后，用1 mL注射器反復抽吸，使組織充分溶解。每個EP管中放入0.25 mL氯仿，用封口膜封好。渦旋混勻，大約30 s，然后離心 15000 r/min，5～7 min。取上清，用 70%等體積乙醇與上清液混勻放入試劑盒內的柱子中。離心10000 r/min，1 min，棄掉下液。向柱子中加入Buffer I 0.5 mL，離心 10000 r/min，1 min。棄掉下液，向柱子中加入 BufferⅡ 0.5 mL，離心 10000 r/min，1 min，空離10000 r/min，1 min。將柱子放入空離心管中，打開蓋子使乙醇揮發，5～10 min。在柱子中心懸空加入40μL的去離子水，離心10000 r/min，1 min。離心時，EP管的蓋子方向與離心機上的箭頭相同，收集的RNA用紫外可見分光光度計檢測RNA濃度。

1.2.4 mRNA反轉錄體系 RNA的濃度為2000ng/20μL，取RNA總量2～5μg。mRNA反轉錄體系見表1。

表1 mRNA反轉錄2000 ng/20μL體系

1.2.5 qPCR PCR擴增的反應體系體積為20μL，其中 Master mix為 10μL，cDNA 0.25μL，上下游引物（1∶20）各 3.2μL，去離子水3.35μL。

PCR擴增反應程序為：94℃4 min，94℃ 20 s，60℃30 s，72℃30 s循環35次，72℃檢測信號。

引物序列如下：

GLUT4 上游引物：5′?TCAATGGTTGGGAAGG?AAAAG?3′；下游引物：5′?CCC TGATGTTAGCCCTGAG?TAG?3′

GAPDH 上游引物：5′?GGTGCTGAGTATGTCGTGG?AG?3′；下游引物：5′?TTGCTGACAATCTTGAGGGAG?3′

1.2.6 Western blotting 各組大鼠心臟組織分別稱重后，于剪刀冰上剪碎樣品，按1∶5比例加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4℃裂解過夜，4℃10000 r/min低溫離心30 min，取上清，BCA法蛋白濃度測定，每管8μg蛋白分裝，-80℃凍存待用。

10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，4℃轉膜過夜，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，采用電化學發光（ECL）（ECL 試劑盒，Pierce，CA），Kodak?XAR 膠片曝光、顯影。洗膜重新封閉后，β?actin 抗體（1∶10000）孵育，二抗孵育，發光，膠片曝光顯影。以β?actin作為上樣量參照標準。膠片掃描后，用Image?pro Plus 6.0軟件包分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0軟件進行統計學處理，one?way ANOVA 分析，結果以±s表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 心功能檢查 與對照組比較，模型組大鼠心臟的EF、FS均明顯降低，與模型組比較，四君子丸治療組大鼠心臟的EF、FS顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠心臟EF、FS的變化比較（±s）

表2 各組大鼠心臟EF、FS的變化比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組四君子丸治療組FS（%）36.21±2.9325.29±2.16a 35.21±2.15b n888 EF（%）63.88±4.3447.52±3.72a 57.94±1.73b

2.2 各組大鼠心臟中GLUT4 mRNA及其蛋白表達變化 與對照組比較，模型組大鼠心臟組織中GLUT4 mRNA及其蛋白水平顯著降低，與模型組比較，四君子丸治療組顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。各組大鼠心臟組織中GLUT4蛋白表達的電泳結果見圖3。

表3 各組大鼠心臟組織中GLUT4 mRNA及蛋白水平的表達變化（±s）

表3 各組大鼠心臟組織中GLUT4 mRNA及蛋白水平的表達變化（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組四君子丸治療組GLUT4蛋白0.58±0.020.35±0.02a 0.46±0.03b n888 GLUT4 mRNA 1.00±0.000.65±0.03a 0.83±0.02b

圖3 各組大鼠心臟組織中GLUT4蛋白表達的電泳圖

3 討 論

脾為臟象學說的核心之一，中醫脾臟與西醫之脾在生理、病理方面的理解存在很大差異，因此，脾實質研究一直是中西醫結合研究的重點對象之一。臟像理論認為，心為火，脾為土，火生土，心脾乃母子關系，因此心和脾是緊密聯系的，并且心和脾經脈相連，互相絡屬。《靈樞·經別篇》指出：“足陽明之正，屬胃，散之脾，上通于心。”《靈樞·經脈》又云：“脾之大絡，名曰大包，出淵腋下三寸，布胸脅。”說明了脾的支脈，上連于心，脾之絡脈，亦分布于心系所主區域。因此，心病則脾亦病，而脾病也影響心臟的功能。脾主運化，其功能是將水谷化為精微，將其運送到全身，包括心臟，濡養心肌。脾氣健運，則心肌豐滿健壯，運動有力，功能活動正常；若脾氣虛弱，化生乏源，將導致運化失常，心肌軟弱無力。劉健等[2]學者早期的研究已證實，脾氣虛證患者心臟每分心輸出量、左心室有效泵力顯著降低。近期姜曉琳等[3]對脾氣虛證大鼠心肌的研究證明，脾氣虛證大鼠左心室收縮末期容積明顯升高，EF、左心室舒張末期容積、左心室每搏輸出量均有明顯下降。此外，脾氣虛證模型大鼠心肌細胞中線粒體的數量顯著減少，其結構也發生明顯變化，說明脾氣虛證將會導致心臟的能量供應不足，最終引起心臟異常的發生[4]。這些研究都足以說明脾氣虛時，心臟的泵血功能下降。心臟功能的降低主要是由于心肌的能量供應不足而引起的。葡萄糖作為心肌細胞主要供能物質，對心臟的功能起到了至關重要的作用[5]。

葡萄糖是親水的分子，很難通過細胞膜上的磷脂雙分子層結構。葡萄糖要進入細胞內就要由細胞膜上GLUTs來完成。GLUTs被分為兩大類：易化轉運載體（GLUT）和鈉?葡萄糖協同轉運載體（SGLT）。目前所知的GLUTs有14種[6]，其均為蛋白質，分布在不同部位的細胞膜上。在人類心臟所表達的GLUTs有GLUT4、GLUT1、GLUT3、GLUT8、GLUT10、GLUT11、GLUT12 和SGLT1，而GLUT4的表達水平高，是心肌重要的GLUTs。

GLUT4的相對分子質量為 45000～55000，是由509個氨基酸組成的糖蛋白，具有12個跨膜結構域，其C端和N端均位于細胞質內，能形成親水性通道，以便讓葡萄糖分子順著濃度梯度穿過細胞膜[7]。GLUT4在內質網合成，在外殼蛋白復合物Ⅱ的調節下轉運到高爾基體進行修飾[8]，形成轉運囊泡后被轉運至內涵體，進而轉運至反式高爾基網、管型囊等膜性囊泡樣結構中，形成GLUT4儲存囊泡（GSVs）。有研究顯示，GLUT4缺失的小鼠心肌缺血損傷易感性增加、缺血心肌的修復延遲、心臟功能損害及心臟形態的改變，都與葡萄糖的攝取和利用降低有關[9]。因此，GLUT4在心肌細胞的正常表達對于葡萄糖的攝取、利用非常重要，進而影響心臟的功能及代償能力。

四君子丸由黨參、炙甘草、茯苓、白術4種中藥制備而成，具有補脾益氣的功效。琚星萌等[10]的研究顯示，四君子湯可提高脾虛大鼠骨骼肌線粒體氧化磷酸化水平，改善能量代謝，本研究采用四君子丸對脾氣虛模型大鼠進行治療，從另一個方面證實脾氣虛大鼠心臟的能量不足與GLUT4的表達水平相關。

脾氣虛證與GLUTs間的關系已有相關文獻報道。如：在脾虛證功能性消化不良大鼠的小腸內GLUT1表達明顯降低[11]，并且脾虛狀態下的大鼠，其下丘腦組織中GLUT1、GLUT3表達及空腸組織中的GLUT5表達水平均顯著降低[12?13]。這些GLUTs的異常表達，導致葡萄糖不能正常轉運，從而引起器官組織的能量代謝障礙，并最終使器官的功能下降。然而，脾氣虛證對心肌細胞中GLUT4的影響尚鮮見文獻報道，基于此，在本實驗中，通過建立脾氣虛的大鼠模型，采用western blotting和qPCR的實驗方法，考察在脾氣虛狀態下，檢測大鼠心肌細胞中GLUT4 mRNA及其蛋白表達水平的情況，結果發現，與對照組相比較，模型組大鼠GLUT4 mRNA及其蛋白表達水平明顯降低，而四君子丸治療組GLUT4 mRNA及其蛋白表達的水平明顯提高。為了進一步研究GLUT4的降低能否影響心肌的功能，本研究通過超聲進行心功能檢查，結果顯示，模型組大鼠心臟的EF、FS明顯降低，而四君子丸治療組明顯提高。

綜上所述，GLUT4在葡萄糖的轉運過程中扮演著非常重要的角色，對心肌葡萄糖的利用有不可或缺的作用。在脾氣虛的狀態下，心肌細胞中GLUT4表達明顯降低，導致葡萄糖轉運異常，心臟供能不足，可能是引起心功能下降的機制之一。通過對脾氣虛證大鼠心肌GLUT4的研究，為進一步探討臨床脾氣虛證患者心臟功能異常的發生、發展及防治心肌能量代謝性疾病提供可靠的理論依據。

[1] 余亞信，李學軍.脾氣虛與能量代謝障礙[J].中國醫藥指南，2008，6（24）：293?295.

[2] 劉健，劉春麗，方朝暉，等.脾氣虛證心功能動態變化的臨床與實驗研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，1998，4（1）：40?42.

[3] 姜曉琳，張立德.脾氣虛證模型大鼠中BNP介導的cAMP?PKA信號通路對bFGF表達的影響[J].中國病理生理雜志，2016，32（2）：251?255.

[4] 李思琦，張哲，楊關林.益氣健脾方對脾氣虛證模型大鼠心肌細胞線粒體呼吸鏈酶復合物活性的影響[J].中國醫科大學學報，2017，46（6）：515?518.

[5]KANTOR P，LUCIEN A，KOZAK R，et al.The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long?chain 3?ketoacyl coenzyme a thiolase[J].Circ Res，2000，86（5）：580?588.

[6] THORENSB，MUECKLERM.Glucosetransportersinthe21stCentury[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298（2）：E141?145.

[7]STEINBUSCH LK，SCHWENK RW，OUWENS DM，et al.Subcellular trafticking ofthe substrate transporters GLUT4 and CD36 in cardiomyocytes[J].Cell Mol Life Sci，2011，68（15）：2525?2538.

[8] RUSSELL C，STAGG SM.New insights into the structural mechanisms of the COPII coat[J].Traffic，2010，11（3）：303?310.

[9]WEISS RG，CHATHAM JC，GEORGAKOPOLOUS D，et al.An increase in the myocardial PCr/ATP ratio in GLUT4 null mice[J].J FASEB，2002，16（6）：613?615.

[10]琚星萌，宋雅芳，雷孝文，等.四君子湯對脾虛大鼠骨骼肌SDH活性及PGC?1α 基因和蛋白表達的影響[J].時珍國醫國藥，2017，28（4）：802?804.

[11]呂林，王鳳云，唐旭東，等.脾虛1號方對脾虛證功能性消化不良大鼠小腸葡萄糖轉運蛋白1的影響[J].北京中醫藥大學學報，2017，40（6）：456?462.

[12]叢培瑋，尚冰，王艷杰，等.脾氣虛和脾陽虛模型大鼠腦腸肽與下丘腦葡萄糖轉運體1及葡萄糖轉運體3表達水平變化的實驗研究[J].中國全科醫學，2016，19（18）：2201?2205.

[13]尚冰，叢培瑋，王艷杰，等.脾氣虛和脾陽虛模型大鼠空腸組織葡萄糖轉運體5表達水平變化的實驗研究[J].中國全科醫學，2016，19（3）：332?336.