肝細(xì)胞肝癌AMPK磷酸化及其與預(yù)后的關(guān)系

李仕強，羅 亞，廖東平，陳曉東，張 海（重慶市九龍坡區(qū)第二人民醫(yī)院400052）

肝癌是惡性程度很高的腫瘤，死亡率僅次于胃癌，居我國癌癥死亡率第2位[1]。近年來包括熱消融、經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞（TACE）、索拉非尼等多種治療發(fā)展迅速，但手術(shù)切除依然是肝癌治療的最主要手段，缺乏有效的手術(shù)切除后預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)依然是肝癌綜合管理中的難點。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是細(xì)胞能量代謝的感受器，是鏈接代謝和細(xì)胞信號通路的樞紐，AMPK通過磷酸化激活，磷酸化的AMPK（p?AMPK）可調(diào)節(jié)自噬、細(xì)胞周期、凋亡、蛋白合成和脂肪酸合成等多種細(xì)胞生物學(xué)行為[2]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，p?AMPK與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但p?AMPK是否可作為肝癌術(shù)后預(yù)測預(yù)后的因素少有報道。本研究旨在收集肝癌術(shù)后病理標(biāo)本，研究p?AMPK在肝癌組織中的表達(dá)，并通過長期隨訪觀察p?AMPK與肝癌預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）2013年5月至2015年5月在本院診斷為“原發(fā)性肝癌”；（2）在本院行肝葉切除術(shù)；（3）病理診斷為肝細(xì)胞性肝癌。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非首次行肝葉切除術(shù)；（2）術(shù)前曾接受TACE或熱消融治療；（3）臨床資料不完整；（4）無可用的肝癌組織石蠟標(biāo)本。

本研究所有患者均在術(shù)前簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。病理診斷結(jié)果經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確認(rèn)。

1.2 標(biāo)本來源 相應(yīng)的肝癌石蠟標(biāo)本從病理科提取并切片。

1.3 試劑 p?AMPK（Thr172）抗體（CST：8208），免疫組織化學(xué)（SP）試劑盒（北京中杉金橋：SP9001）。

1.4 方法

1.4.1 檢測p?AMPK的表達(dá)情況 采用SP法，具體步驟如下：65℃烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，一抗4℃斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。每例切片隨機選取5個高倍鏡視野進行結(jié)果判定，2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法觀察。結(jié)果評分：（1）染色深度，無陽性染色為0分，淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐或棕褐色為3分；（2）陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)小于或等于5%計0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。二者得分相加低于4分為p?AMPK低表達(dá)，≥4分為p?AMPK 高表達(dá)。

1.4.2 隨訪 每3～6個月復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、甲胎蛋白（AFP）、腹部彩色多普勒超聲，若可疑復(fù)發(fā)，采用增強CT或MRI明確診斷，未定期來本院復(fù)查的患者采用電話隨訪。隨訪至患者死亡或達(dá)隨訪終點（2017年1月）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，滿足方差齊性，采用t檢驗，若不滿足方差齊性，則采用U檢驗。采用Kaplan?Meier法進行生存分析，單因素COX分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入多因素COX分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況 選取2013年5月至2015年5月第一作者進修醫(yī)院（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院）因肝癌行肝葉切除術(shù)的患者共167例，16例因病理診斷為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌或混合性肝癌而排除，5例缺乏完整的臨床資料，失訪7例，3例未找到可用的石蠟標(biāo)本，最終納入136例（術(shù)后病理明確為肝細(xì)胞肝癌）。其中男87例（64.0%）；平均年齡（58.9±10.5）歲，24例（17.6%）年齡小于50歲；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期患者77例（56.6%）；低分化34例（25.0%）；單結(jié)節(jié)腫瘤73例（53.7%）；腫瘤最大直徑小于5 cm者58例（42.6%）；107例（78.7%）有肝硬化背景；97例（71.3%）AFP≥400μg/L；乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性 125例（91.9%）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）（78.8±99.1）U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）（162.8±372.3）U/L，凝血酶原時間（PT）（12.9±1.3）s，清蛋白（ALB）（38.9±6.5）g/L。

2.2 p?AMPK與肝癌臨床病理的關(guān)系 91例（66.9%）患者肝癌組織中p?AMPK低表達(dá)，45例（33.1%）患者肝癌組織中p?AMPK高表達(dá)，陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1）。p?AMPK高表達(dá)組HBsAg陽性率高于p?AMPK低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（95.6%vs.84.4%，P＜0.05）。p?AMPK低、高表達(dá)患者性別，年齡，肝硬化背景，AFP，腫瘤的大小、數(shù)目、分期，血管浸潤，總膽紅素（TBIL），ALT，AST，PT，ALB 比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 p?AMPK在肝癌組織中的表達(dá)情況（SP，200×）

表1 p?AMPK與肝癌臨床病理的關(guān)系

2.3 p?AMPK的表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系

2.3.1 p?AMPK的差異表達(dá)與術(shù)后總體生存率、無瘤生存率的Kaplan?Meier分析 p?AMPK低表達(dá)的患者1、2、3年總體生存率分別為41.4%、25.8%、19.4%，低于p?AMPK 高表達(dá)的患者（74.0%、51.6%、48.4%）；p?AMPK低表達(dá)的患者1、3、5年無瘤生存率分別為28.0%、20.4%、17.5%，低于 p?AMPK 高表達(dá)的患者（52.7%、43.2%、43.2%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、3。

2.3.2 肝癌預(yù)后的單因素及多因素回歸分析 單因素分析顯示，腫瘤的大小、數(shù)目，TNM分期，分化程度，HBsAg和p?AMPK的表達(dá)與總體生存率及無瘤生存率有關(guān)（P＜0.05），而性別、年齡、AFP、肝硬化、血管浸潤、TBIL、ALT、AST、PT和ALB與總體生存率及無瘤生存率無關(guān)（P＞0.05）。多因素 COX 回歸分析顯示，p?AMPK低表達(dá)是總體生存率及無瘤生存率的獨立危險因素（HR2.894，95%CI1.702～4.922，P＜0.05；HR2.246，95%CI1.381～3.652，P＜0.05）。見表2。

圖2 p?AMPK的差異表達(dá)與術(shù)后總體生存率的Kaplan?Meier分析

圖3 p?AMPK的差異表達(dá)與術(shù)后無瘤生存率的Kaplan?Meier分析

3 討 論

二甲雙胍作為降糖藥廣泛應(yīng)用于2型糖尿病，近年的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對肝癌有重要的抑制作用。CHEN等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者中，每增加1年二甲雙胍的使用時間，肝癌的發(fā)病率可降低7%，其機制與AMPK激活后，上調(diào)p21和p27，下調(diào)cyclin D1有關(guān)，二甲雙胍對肝癌發(fā)生的保護作用在后續(xù)的研究中得到了進一步驗證[4]。DEPERALTA等[5]在大鼠實肝硬化模型中，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可通過抑制肝臟祖細(xì)胞的激活從而抑制肝癌的發(fā)生。不僅如此，對手術(shù)切除的肝癌患者，二甲雙胍還可抑制肝癌復(fù)發(fā)，提高患者的總體生存率[6]。對接受肝移植的肝癌患者，二甲雙胍同樣顯示出了保護作用[7]。這些結(jié)果均表明，從肝癌的發(fā)生到預(yù)后，二甲雙胍具有多方面的抑制作用。大量的研究結(jié)果顯示，二甲雙胍主要通過激活A(yù)MPK，從而對肝癌細(xì)胞發(fā)揮抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、逆轉(zhuǎn)耐藥等多方面的作用[7?11]。但 p?AMPK 是可作為預(yù)測肝癌預(yù)后的因素，目前僅有東方肝膽王紅陽原始團隊進行過研究，他們收集了273例肝癌患者的臨床樣本，發(fā)現(xiàn)癌組織中p?AMPK的表達(dá)明顯低于癌旁組織，且在肝癌樣本中，197例（72.2%）p?AMPK 低表達(dá)，多因素分析中 p?AMPK 是肝癌預(yù)后不良的獨立危險因素[12]。本研究通過收集136例肝癌手術(shù)患者臨床標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中p?AMPK的表達(dá)受到明顯的抑制，91例（66.9%）患者p?AMPK低表達(dá)。多因素COX回歸分析均顯示p?AMPK低表達(dá)是總體生存率及無瘤生存率的獨立危險因素（HR2.894，95%CI1.702～4.922，P＜0.05；HR2.246，95%CI1.381～3.652，P＜0.05），與東方肝膽王紅陽原始團隊的研究結(jié)果相符。說明p?AMPK對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有重要影響，可作為判斷肝癌預(yù)后的一個新的指標(biāo)。

在本研究中，受限于僅有肝癌組織石蠟標(biāo)本，我們只能通過SP法來檢測p?AMPK的表達(dá)情況，可能存在一定的偏倚，另一方面，我們的樣本量相對較小。盡管如此，我們通過對基層單位的肝癌臨床數(shù)據(jù)進行研究分析，可對國內(nèi)一流醫(yī)療中心的研究結(jié)果進行驗證、補充，仍具有重要的臨床價值。

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