高通量測序技術在野生動物食性分析中的應用

劉 剛,寧 宇,夏曉飛,龔明昊,*

1 中國林業科學研究院濕地研究所,北京 100091 2 濕地生態功能與恢復北京市重點實驗室,北京 100091 3 北京自然博物館,北京 100050

食性研究是動物生態學的重要內容之一,是了解動物與環境關系及捕食者與獵物關系的前提,同時也是構建棲息地選擇和利用模型、探討取食對策和營養流動、評估物種生存狀況和生態系統功能等熱點問題的基礎[1- 4]。食性分析方法的準確性和精確性直接關系到食性相關理論的探索,同時也關乎食性結果應用于動物保護的實踐。研究者對食性相關問題的研究越來越深入,食性分析方法也在不斷改進和更新。傳統食性方法,大多基于形態學鑒定、光譜結構差異或同位素原理,解決了很多與食性相關的生態學問題,但由于受到技術和適用范圍的限制,這些方法還存在一些不足(表1)。

表1 各種食性分析方法的分析依據、優劣及適用范圍的比較

隨著高通量測序技術的發展,該技術逐漸擴展到野生動物的食性分析,相關研究也在增多。高通量測序技術由于具有靈敏度高和數據通量大的特點,能在一個測序平臺產生上百萬條reads,其高效性特別受到研究者的青睞 (表 1)。另外,對于PCR來說,短片段的效率要高于長片段,而食性分析樣品(糞便、食團或胃容物等),都存在不同程度的降解,較適宜短片段擴增,這意味著,高通量測序的讀長范圍非常適合食性分析 (表 1);高通量測序以其高靈敏性,能捕獲頻次較低的DNA序列,表明少見取食的食物DNA也能被檢測到;高通量測序產生的DNA序列,通過與數據庫比對,可將食物的分類精確到種級別分類單元,準確性高 (表 1);基于DNA序列數,還可判斷動物對食物取食的相對量和偏好。盡管高通量測序的優勢較為明顯,但由于涉及到的步驟較多,受到的影響因素較為復雜,目前高通量測序應用于食性分析還屬于研究比較薄弱的領域。本文就高通量測序技術應用于野生動物食性分析進行方法概述,總結相關研究動態,評述存在的問題,并展望應用前景。

1 糞便DNA和高通量測序用于食性分析的流程

基于高通量測序分析動物食性的基本流程是：提取食性樣品中食物殘渣的DNA→選擇兼備高通用性和高分辨率的DNA條形碼引物→PCR擴增(引物可加相應的寡核苷酸標簽)→高通量擴增子測序→獲得DNA序列→生物信息學分析(序列篩選、比對、判定)→判斷食性樣品中各個DNA序列所對應的食物種類[17]。

1.1 樣品采集、保存和DNA提取

目前高通量測序用于食性分析的研究中,絕大多數以糞便作為樣品,有少數幾項分析嚙齒動物和蝗蟲食性的研究采用胃內容物[18-19],還有一些研究鳥類食性的,除了用糞便外,還采用食團[20]。糞便是特別適宜于研究野生動物尤其是珍稀瀕危動物的非損傷性樣品,通過不同的提取方法,可從糞便中提取出目標動物DNA、食物DNA、微生物DNA、寄生蟲DNA[21]。糞便的新鮮程度是決定糞便DNA質量的關鍵,直接影響DNA提取、PCR和測序的效果。糞便DNA的質量還與糞便的采集部位有關,取糞便(糞球、糞團或糞粒)的中心、中層和外皮進行混合,能顯著提高檢出率,尤其是攝食量較少的食物。在取樣數量方面,Erickson等[22]對同一份糞便樣品,取樣3次分別進行高通量測序,發現樣品內差異顯著小于樣品間差異,表明沒有必要對同一份糞便樣品重復取樣。

糞便保存方法和DNA提取方法,以及二者的交互作用,決定著所采集糞便中食物殘渣DNA的質量。保存方法和提取方法對分子標記用于保護遺傳學研究的影響已有很多[23],但對食性分析的影響,目前還未見到相關研究。在食性分析中,常用的糞便保存方法有硅膠干燥法(嚙齒類[24]; 棕熊[25])、緩沖液保存法(蜥蜴[26])、乙醇法(蝙蝠[27])、冷凍法(蝙蝠[28]; 蜥蜴[26]; 海豹[29]; 大鴇[30])等,也有采用兩步保存法的,如乙醇和冷凍保存 (蝙蝠[31]),乙醇和硅膠保存(豹貓[32])。研究者還需綜合考慮保存方法在野外的可行性,以及運輸的便利性。

糞便DNA提取方法大多采用較為常用的商業化糞便DNA提取試劑盒,文獻中以QIAamp DNA Stool Mini Kit最為常見,但也有例外[33]。研究表明,QIAamp DNA Stool Mini Kit中的inhibitex含有馬鈴薯吸附劑,可能會在DNA提取時混入,導致馬鈴薯出現在本不取食馬鈴薯的動物的食譜中,因此,在分析植食性動物的食性時盡可能避免使用這種試劑盒[34]。MoBio, Epicentre, 和 Qiagen 的糞便DNA提取試劑盒,在小嘴烏鴉(Corvuscorone)食性分析上效果均不如CTAB提取法[35]。在提取西藍鴝(Sialiamexicana)的糞便DNA用作高通量測序時,QIAamp DNA Stool Mini Kit的提取效率顯著低于Zymo Soil/Fecal DNA MiniPrep Kit[36]。在選擇糞便DNA提取方法時,文獻中食性相近的物種可作為參考,但還需研究者摸索出適宜的方法。

1.2 PCR擴增和高通量測序

動物食性一般可分為動物性食物、植物性食物和雜食性。從食性分析樣品中提取的DNA

一般存在一定程度的降解,長度過長的DNA條形碼在PCR擴增時效果欠佳,長度過短PCR效果好但分辨率又會下降。因此,高通量測序技術應用于食性分析,需要結合DNA條形碼的特性和動物總體食性特征,不同的食性特征要求選擇不同的DNA條形碼或宏條形碼(metabarcoding) (表2)。

高通量測序應用于食性分析,其最大的優勢是可將多個PCR產物混合起來,在一個測序反應中得到巨量數據。通過對引物兩端加上相應的寡核苷酸標簽,待測序結束后,在數據分析過程中可根據標簽對應到個體。寡核苷酸多聚體的堿基數取決于混樣個體數,樣品越多,多聚體堿基數越多,但過多會影響PCR效率。一般采用八聚體,且八聚體間差異應大于5,即可滿足要求[39]。將PCR產物等量混合,構建擴增子文庫,進行高通量測序。如何篩選高通量測序得到序列,直接關乎后續數據的處理。在此,主要考慮PCR和高通量測序產生的冗余序列,可通過相應的程序予以篩選和剔除[26, 32]。

表2 高通量測序用于動物食性分析中常用的DNA條形碼類型和序列

1.3 構建本地潛在食源DNA條形碼數據庫

通過高通量測序平臺產生的序列需要與數據庫進行比對,才能判斷DNA序列對應的食物種屬[40]。由于動物和植物的地理分布存在很大差異,公共數據庫 (NCBI,EMBL,DDBJ) 僅收錄了研究者上傳的局部范圍內的部分DNA條形碼,還遠遠無法滿足食性分析研究者的需求[17]。另外,DNA條形碼的種類繁多,分辨率也存在差異。根據動物的食性,需選擇不同的DNA條形碼或DNA條形碼組合,但公共數據庫如果缺乏這種DNA條形碼數據,將會降低食性分析的分類精度,進而影響食性結果用于瀕危動物保護生物學實踐。這就要求,研究者需根據研究目的構建基于所選DNA條形碼的全部本地潛在食源DNA條形碼數據庫。

構建本地DNA條形碼的步驟：(1) 根據目標動物的活動區域覓食區域,采集潛在食源的組織材料,輔以分類學家的形態學鑒定,從物種水平確定食源種屬; (2) 對采集的食源組織材料,提取DNA,基于食性分析時所選擇的DNA條形碼,合成相應引物,進行PCR擴增;(3) 通過Sanger測序,構建本地潛在食源DNA條形碼數據庫,供后續高通量測序得出的DNA序列進行比對。通過構建本地數據庫或者增加DNA條形碼的種類,能在一定程度上提升分辨率[34],以分析植食性動物為例,構建rbcL庫可使序列鑒定到種水平的比例達72%[22]。而未構建地方數據庫,鑒定到種的比例顯著降低,如在比對蝙蝠食性的高通量數據時,僅有4%—20%的序列能夠鑒定到種或屬水平[37]。更為重要的是,本地DNA條形碼庫本身就可直接用于生物多樣性的評估和監測[41]。

1.4 高通量測序數據分析

在與建立的本地數據庫和公共數據庫進行比對時,通過序列相似性判斷序列的物種歸屬,但閾值的設定目前仍然存在爭議。一部分研究者采用寬松的相似性閾值來判定種分類階元,如采用97%[18, 31],或采用更為嚴謹的閾值,如采用99%[37, 42]和100%[26],也有的建議根據不同的DNA條形碼和研究目的,采用不同的閾值[25]。對于一些未構建本地數據庫的研究,在后續分類歸屬階段,雖然可以采取聚類方法,通過分子可操作單位 (MOTU,Molecular operational taxonomic units)完成食物組成的差異分析,但總體來說,構建地方數據庫將有助于提高序列的分類歸屬,明確物種具體取食哪種食物,也能推動食性研究結果應用于物種的保護實踐[17]。

2 食性分析的應用進展

2.1 食物組成分析

食性研究中,首先需要確定動物的食物組成。通過高通量測序,食物被鑒定出的種類和比例是形態學鑒定無法相比的。Egeter等[43]利用高通量測序技術對褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)和普通刺猬(Erinaceuseuropaeus) 攝食蛙的種類進行研究,發現與形態學顯微分析相比,高通量測序技術將胃內容物中蛙的檢測率從2%提升到70%,將糞便中蛙的檢測率從0提升到53%。江允中等[44]分析了褐河烏 (CincluspallasiiTemminck)的食性,發現食物組成涵蓋6目8科11屬,其中以家蠅科黑蠅屬(Ophyra)占優勢,但由于沒有構建本地數據庫,近50%的序列無法鑒定。Brown等[33]研究了奧地利滑蛇(Coronellaaustriaca),首次發現一些小型哺乳動物也是蛇的主要食物。Leray等[45]利用高通量測序分析了3種魚的食物組成,檢測到292個可操作分類單元 (Operational taxanomic units, OTUs),其中51%可鑒定到種水平,另外26%可鑒定到屬水平。高通量測序甚至還用于無脊椎動物的食性,Hamb?ck等[46]通過高通量測序技術鑒定了542只狼蛛胃內容物的DNA組成,發現了223個OTUs,其中99個可鑒定到種水平。

2.2 食物對種內和種間關系的影響

食物是動物生存和繁殖所需能量和營養的來源,食物關系則反映了物種間的基本關系。

食性存在物種差異,同域分布的物種為了避免競爭,可能會進化出不同的覓食對策,如選擇不同的微生境、取食不同的食物或者在不同的時間覓食,以滿足能量和營養需求[47]。食物因子在物種共存和物種競爭中發揮著重要作用[48],而研究食性是探明食物選擇機制的前提。對于同一物種,由于雌雄個體承擔的繁殖任務不同可能表現出性別差異,甚至由于個性因素而表現出食性的個體差異[49]。Lopes等[24]通過高通量測序分析和比較了兩種櫛鼠的食物組成,發現二者食性相差顯著,但由于未進行季節性比較,不排除在高能量需求條件下,如繁殖季節,二者存在食物重疊或部分重疊的可能。Soininen等[50]比較了分布于北極的兩種旅鼠的冬季食性,結合高通量數據和食物資源調查數據,發現兩種旅鼠食物組成高度重疊,但是該地區豐富的食物能夠滿足需求,因此種間競爭并不明顯。

食性研究為研究行蹤隱秘的物種與資源之間的關系提供了新的手段,有助于揭示物種共存和食物重疊的機制。來自蝙蝠的高通量測序食性研究表明,同域分布的兩種形態相近的近緣食蟲蝙蝠,在主要食物上表現出高度重疊,但在各自的專性食物上卻相互分開,證實了食物資源分配是物種共存的機制[51]。Burgar等[37]隨后利用高通量測序又分析了另外3種食蟲蝙蝠的食性,發現蝙蝠間形態學差異越大,在資源利用方面表現出更顯著的異質性,而且這種異質性與生長發育階段和性別有關。

2.3 食性與行為關系

動物是否遷徙、何時遷徙以及遷徙到何處,除受遺傳因素控制外,環境因子如食物也起到了重要作用[52]。遷徙過程對能量需求非常高,動物通過生理、行為和食性變化以適應環境的改變。糞便組織顯微鑒定發現納氏伏翼(Pipistrellusnathusii)在秋季遷徙期和夏季居留期食性相似度較高,但分辨率更高的高通量測序結果則顯示這兩個時期的食性差異較大,夏季以森林昆蟲為主,而秋季則以濕地昆蟲為主,納氏伏翼采取了不同的覓食策略以適應當地的食物資源變化[42]。鳥類遷徙前夕,通常會高效地補充能量和營養物質,Bounas 和 Sotiropoulos[53]關于黃爪隼(Falconaumanni)的研究證實了這種覓食策略,即黃爪隼通過食譜變窄、頻繁覓食和攝取能量更高的直翅目動物來為遷徙做準備。

隨著高通量測序技術運用于食性研究,食性分析的精度得以提高,食性定量分析的準確性顯著上升,也對一些通過行為學觀察或形態學鑒定手段建立的食性理論提出了挑戰。最佳覓食理論認為,專食性動物在遇到食物資源減少的情況時,會轉向進食一些之前不喜選擇的食物,轉變為泛食性物種[31]。但是,對水鼠耳蝠(Myotisdaubentonii)的食性分析發現,即使在冬眠前能量需求大、食物可獲得性變小的條件下,也未表現出食譜拓寬的跡象,表明水鼠耳蝠對食物的選擇偏好不受時空限制[31]。具有性二型特征的物種,一般在食物資源利用上表現出性別差異,Kartzinel 和 Pringle[26]利用高通量測序技術分析了沙氏變色蜥(Anolissagrei)的食性,發現雌性個體的食物多樣性高于雄性。

2.4 捕食者-獵物-環境關系

棲息地為動物提供了所需的食物資源,獨特的生態環境可能進化出了特異的食物選擇行為,同時棲息地的變化也會導致食物可獲得性和食物多樣性的變化。食性與棲息地關系的研究為了解動物的覓食策略和棲息地選擇提供了依據,高通量測序技術能在較大的空間尺度上高效地分析不同棲息地動物的食性。Clare等[28]利用高通量測序分析了不同棲息地棕色鼠耳蝠 (Myotislucifugus) 的食性,結果表明：受污染較輕棲息地內的蝙蝠食物較豐富,提出了蝙蝠的食物質量可作為評價環境質量的一個指標。Trevelline等[54]對路易斯安那水鶇 (Parkesiamotacilla) 通過高通量測序技術進行食性分析,發現水鶇食物中陸生昆蟲占比很大,改變了之前認為水鶇偏好污染水生環境中的昆蟲的觀點。

捕食者、獵物和環境間的關系和相互作用,一直以來是生態學家關注的方向。食草動物可能與自然植物群落的形成和分布關系密切,甚至對外來入侵植物也有影響。Erickson等[22]通過高通量測序技術分析了白尾鹿(Odocoileusvirginianus)對本地植物和外來入侵植物的取食偏好,發現白尾鹿選擇本地植物作為主要食物,并在一定程度上促進了外來入侵植物的擴張。Khanam等[19]分析了3種嚙齒動物的食性,掌握了它們覓食植物和無脊椎動物的種類,為鼠害的生物防控提供了科學依據。

3 高通量測序用于食性分析的影響因素和展望

3.1 PCR影響

在食性相關的實驗研究和理論研究中,高通量測序技術應用越來越普遍,但也存在一些不容忽視的局限性和不確定性[17, 40]。高通量測序技術應用于食性分析主要是基于擴增子測序,模板 DNA的質量、PCR和高通量測序技術本身均會單獨或交互影響最終結果。無論是以糞便還是以胃內容物和食團作為樣品,從中提取的DNA均存在不同程度的降解,并含有PCR抑制劑,均對PCR擴增效率和正確率產生不利影響[55]。另外,為了節約成本,在引物上加上區分個體的標簽,也會造成PCR錯配的發生[56]。PCR階段的誤差,傳遞到高通量測序過程,還會被放大,進一步影響最終結果。樣品DNA中不同DNA片段,如果PCR效率相差2%,則導致在35個循環后PCR產物拷貝數相差30%[17]。

鑒于高通量測序具有能夠在一個測序反應中實現同時測定不同類型食物DNA的特點,即將動物和植物的DNA條形碼置于復合PCR中構成宏DNA條形碼,極大提高了測序效率,降低了測序成本。比如,De Barba等[25]開發了一種基于宏DNA條形碼的非損傷性食性分析方法,對棕熊(Ursusarctos)的食性進行全面分析,定量分析了棕熊食譜中脊椎動物、無脊椎動物和植物所占的比例。但是,動物和植物DNA條形碼的引物在PCR時,其擴增效率是不一致的,擴增效率高的很可能抑制擴增效率低的,導致PCR受到抑制的食物被低估。因此,在高通量測序應用于雜食動物進行復合PCR時,很有必要設置陽性對照和重復。

3.2 污染影響

污染是高通量測序應用于食性分析一個不可忽視的誤差來源。在采樣、樣品處理和PCR環節,如果存在污染,會在測序過程被靈敏度非常高的高通量測序平臺捕獲,導致食物多樣性被高估或影響食性差異分析結果,比如,在分析埃及獴(Herpestesichneumon)食物的高通量數據時,就發現樣品間存在交叉感染[57]。還有一個污染來源屬于生態型,即動物在覓食食物后,被更高級別的捕食者取食,在分析更高級別捕食者食性時,就不可避免引入污染,這在食性分析中也是需要特別注意的問題[17],但目前還沒有相關研究評估這種二次污染的影響[26]。因此,在分析復雜食物鏈結構中的物種時,需特別注意二次污染的影響[58]。另外,在分析食肉動物的食性時,使用的DNA條形碼很可能同時將目標動物的相應片段擴增出來,對后續高通量測序形成干擾和占用測序資源[59],通過設計blocking oligo可阻斷引物與捕食者的模板DNA結合[25]。

3.3 定量分析

相對于食物種類和食物多樣性,動物攝取某種食物所占比例以及對食物的偏好選擇,是研究者更為關注的問題。基于高通量測序得出食物DNA的序列數,是否定量反映了食物被攝取的量和比例,目前仍然存在爭議[56]。高通量測序產生的DNA序列數較多的食物,有可能被偶爾攝食,而序列數少的卻有可能是主要食物或喜好食物[17]。造成這種偏差的原因包括生物因素和技術因素,生物因素：同種食物中不同細胞的DNA拷貝數存在差異、食物不同組織所含細胞數不同、動物對每種食物的消化率等;技術因素：對不同食物DNA模板的PCR擴增效率差異、引物標簽引入的誤差、PCR擴增可能發生錯配、測序方向、冗余數據剔除參數設置等。這些因素對食性數據的定量化,帶來較大困擾。比如,通過企鵝被喂食4種魚的控制實驗發現,高通量測序數據與平行進行的定量PCR所得數據一致,表明高通量測序的序列數可定量反映攝食量,即DNA序列數高的食物,被攝食越多[60]。然而,有關港海豹(Phocavitulina)的研究表明,喂食魚的比例與高通量測序得出的序列數比例并不相符[56]。

既然基于擴增子測序的食性分析還存在不足,怎樣才能讓高通量測序技術數據在定性和定量上可靠而又可信呢？在同一個研究中,除了進行高通量測序外,平行開展另一種食性分析方法是驗證數據準確性的有效途徑。Srivathsan等[38]采用全基因組shotgun方法定量分析了白臀葉猴(Pygathrixnemaeus)的食性,該方法不需要PCR,發現全基因組法比擴增子測序得出了更高的食物多樣性,但通過比較分析,也驗證了擴增子測序法在相對定量上是可信的。值得注意的是,有關白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的研究卻發現全基因組法得出的食物多樣性明顯偏低,大部分序列為微生物,相反擴增子測序法準確性更高[22]。

采用高通量測序技術分析食性,其數據量和將食物鑒定到種水平的特點,是其他食性分析方法所不具備的。由于該技術應用于食性分析才剛剛興起,一些技術細節和影響因素仍需注意。隨著高通量測序技術逐漸成熟和穩定，以及研究者對誤差因素的重視和控制,該技術將得到更廣泛和更深入的應用。目前,世界上絕大多數動物的食性,現在還處于較為粗略的定性描述階段,隨著高通量測序技術成本降低,期待更多的動物學家利用該技術分析食性,整合食性結果去解釋一些更加復雜但又富有意義的問題,比如,探討動物對植物的采食與植物授粉和種子擴散生態過程的關系,確定哪些植物的授粉過程需要哪種動物的介導,定位動物在食物網結構中扮演的生態角色[61];研究氣候變化對動物食性偏好和轉變的影響,預測動物喜食食物受氣候變化的影響,模擬動物如何通過轉變食性以適應全球變暖[62];高通量測序技術與其他技術手段聯合,將為食性分析的應用開啟更廣闊的空間。高通量測序在確定食物種類和差異上獨具優勢,而穩定同位素能夠分析食物的來源和能量流動,兩種方法相輔相成,對復雜食物網的研究具有重要應用前景[46]。隨著高通量測序技術在定量分析食性方面日漸成熟,有助于聯合營養幾何學深入探討動物的營養需求和覓食策略[63]。

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