不同供水下白羊草(Bothriochloa ischaemum)離體根呼吸特征
——基于穩定碳同位素示蹤技術

劉 琦,李 鵬,劉 瑩,肖 列,黃 鵬,湯珊珊

西安理工大學陜西省西北旱區生態水利工程國家重點實驗室培育基地,西安 710048

土壤呼吸是生態系統碳循環的重要環節,作為大氣CO2重要的來源和土壤碳庫主要的輸出途徑,是陸地生態系統第二大碳通量,全球每年由土壤釋放的CO2量為98 Pg[1],土壤CO2呼吸會顯著加劇大氣中CO2濃度的增高[2],加劇溫室效應。植物根系是土壤C輸入的主要途徑[3-4],植物光合作用固定的碳量約50%由根呼吸釋放[5-6],研究表明根呼吸占土壤呼吸的大部分,由根呼吸損失的碳占土壤碳釋放量的40%—70%[7- 10],這表明研究根呼吸對揭示生態系統碳收支及生物圈碳平衡具有的重要意義。

目前,有學者研究發現土壤水分、溫度、養分等環境因素可通過影響植物光合同化物的形成及其在葉、莖和根中的分配,進而影響根系形態和根系呼吸[11-12]。測量植物根呼吸的方法分為直接法和間接法,直接法包括離體根法、同位素法、PVC 管氣室法等,間接法分環割法和根排除法,這些研究方法可得出根呼吸速率變化和根呼吸對土壤呼吸的貢獻率[13- 15]。測定方法同樣對根呼吸的估計存在差異性,如在對溫帶草原的研究中,同位素法和排除根法所測定的根呼吸對土壤總呼吸的貢獻率分別為19%和39%[13,16]。穩定碳同位素13C脈沖標記技術是研究根系呼吸有機碳輸入、輸出的新方法,有著靈敏度高、擾動較小和理論上較合理等優點[17],可定量研究植物輸入到根部的碳[18]和根際呼吸[19-20],但不能反應光合碳從地上傳輸到根系后的代謝過程,即根系中的碳在不同時間、不同供水條件下的呼吸釋放過程少有研究,這是估算C平衡中的關鍵,需要相關研究支持。

白羊草(Bothriochloaischaemum),是多年生禾本科孔穎草屬C4植物,為典型旱生植物,其繁殖能力快、再生能力強、耐踩踏、耐旱、區域適應性強,成為陜北黃土丘陵區生產力較高的草種,白羊草的根系發達呈網狀,能攔截地表降雨有蓄水保土的作用,也是黃土高原退化草地恢復和C存儲的重要植物之一。在干旱半干旱區水分脅迫是最普遍的環境脅迫,根系作為土壤和植物物質運移的交換器官[21],研究不同供水下根系對其的響應對揭示植物抗旱性本質有重要的意義[22]。測定離體根呼吸釋放的CO2可研究離體根呼吸速率的變化規律[11],但不能說明光合碳運輸至根系后的運移及釋放過程,而土壤水分、根系形態及根組織養分含量等都可能影響離體根呼吸,因此本文采用穩定碳同位素脈沖標記方法,研究3種供水條件,供水充分(80%田間持水量,HW)、輕度脅迫(60%田間持水量,MW)和重度脅迫(40%田間持水量,LW)下,不同離體時間的白羊草離體根呼吸及其影響因素,為定量研究光合碳傳輸到根系后的呼吸釋放過程及根系固碳提供新思路,以期為在不同水分條件下研究碳固定、代謝和估算提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設計

1.1.1 實驗材料

(1)試驗用土壤和種子情況

實驗于2014年5月在西安理工大學進行。實驗用土壤采于陜北黃土丘陵區以白羊草為優勢種的草地,土壤類型為黃土,去除表層腐殖質和枯落物,取0—30 cm土壤均勻混合裝袋,自然風干后過2 mm篩,同時測定其容重。實驗用白羊草種子于2013年10月采于陜北未受人為影響的草地,采收后裝在紙袋內自然狀態下實驗室儲藏。實驗為盆栽控制實驗,采用自制有機玻璃容器,每盆裝土2.5 kg,容重與陜北采土樣地容重相同,為1.2 g/cm3;總N含量0.69 g/kg;田間持水量為22%。

(2)室內試驗裝置

自制有機玻璃容器：用于播種白羊草種子。采用透明有機玻璃制成長方體容器,尺寸為19 cm×4 cm×27 cm。底部打雙孔,內徑厚度為4 cm,共計需要上述花盆72個。

圖1 雙層密閉有機玻璃標記氣室Fig.1 Double-layer sealed plexiglass labeled air chamber

自制雙層密閉有機玻璃標記氣室：用于測定土壤呼吸速率。采用透明有機玻璃制備的雙層密閉有機玻璃罩長方體容器,內層尺寸為50 cm×50 cm×80 cm,四周及底部密閉,頂部開口,開口尺寸30 cm×30 cm,并配有尺寸相同的帶密封條蓋子;在玻璃罩相對兩側設置外層密閉槽,外層槽厚5 cm,上下密封,僅在上下各留2 cm直徑的進出水口。玻璃罩另相對兩側設置直徑為4 cm的進氣口和出氣口,采用相同尺寸橡膠塞密封,橡膠塞中部打孔,插入外徑8 mm,內徑6 mm導氣管,上部進氣口除插入導氣管外,在橡膠塞中部還插入玻璃導液管,上述所有連接處均用凡士林密封,導氣管連接儀器進氣口和出氣口。共計需要上述氣室3個。如圖1為實驗時在自制雙層密閉有機玻璃標記氣室中對白羊草幼苗進行13C脈沖標記。

自制密閉根呼吸氣室：用于測定離體根呼吸速率,采用透明有機玻璃制備的有機玻璃罩長方體容器,尺寸為20 cm×10 cm×20 cm,頂部及底部密閉,兩側開口,開口尺寸分別為直徑為2 cm的圓孔和直徑為4 cm圓孔,并配有尺寸相同的橡膠塞,橡膠塞中部插入外徑5 mm,內徑4 mm導氣管,分別連接儀器的進氣口和出氣口。共計需要上述氣室4個。

1.1.2 實驗設計

種子于2014年5月1日播種,每個自制有機玻璃容器撒播5穴,出苗后每穴保留生長最旺盛的一株幼苗,未出苗的種穴進行補植。定苗后于2014年7月1日開始控水實驗處理,設3個土壤水分梯度,供水充分(80%田間持水量,HW),輕度脅迫(60%田間持水量,MW),重度脅迫(40%田間持水量,LW);每個水分梯度設21盆重復;同時布設空白土壤樣本9盆,每個水分梯度3盆重復。盆栽土壤含水量控制采用稱重法,每天定時稱重控制澆水,直至2014年10月1日實驗結束。每盆白羊草生物量在控水處理前計入本底值重量,由于幼苗的初始生物量0.867 g與實驗結束時每盆白羊草濕生物量最大值5.812 g差值僅占整體盆栽控水總重量3880 g的0.1%,且控水時間較短,因此忽略白羊草生長重量增加對水分處理控制的影響。

1.2 實驗測定與方法

1.2.113C脈沖標記

標記于2014年9月13—15日9:00—12:00進行。每個水分處理隨機選取12株白羊草幼苗,放在自制雙層密閉有機玻璃標記氣室內。同時標記室內放入盛有約2 g Na2CO3的小燒杯,燒杯頂部連接用于導入HCL的導液管和用于加標記氣體的導氣管,導液管和氣管接至標記氣室外側(連接處密封)。采用CCIA- 36d-EP二氧化碳同位素質譜儀(Los Gatos Research,USA)監控標記室內CO2濃度、δ13C值。標記開始時,用針管注入豐度為99.9%13CO2氣體,標記室內初始CO2濃度450 μmol/mol,δ13C值為5000‰,溫度27—28℃。在標記過程中,標記氣室內CO2濃度低于400 μmol/mol,用針管從外接導管入口注入1 mol/L HCL直至Na2CO3反應放出12CO2氣體使標記氣室CO2濃度達到450 μmol/mol,若δ13C低于5000‰,則由氣管加入13CO2氣體,重復此過程,直至實驗結束。標記時間為120 min,標記結束時標記室內CO2濃度約為450 μmol/mol,δ13C值為4000‰。

1.2.2 樣品采集與離體根呼吸測定

13C脈沖標記結束后0,6,24,48,216,360 h進行樣品采集和離體根系呼吸測定。各處理未標記樣品與標記后360 h樣品同一天(2015年10月1日)按照上述方法采集。在上述采集時段,分別取各水分處理的白羊草幼苗3盆,手動將根系從土壤分離,用鑷子收集根系,分離出的根系蒸餾水沖洗干凈后用濾紙吸干水份,斷口涂抹凡士林后立即放入連接LGR二氧化碳氣體同位素質譜儀的自制根呼吸氣室(采用高速測定模式,每秒記錄一次數據),測定0—2 h根系呼吸速率,掃描根系后,將根系60℃恒溫烘干48 h,稱干重后粉碎,過0.149 mm篩備用。

1.2.3 樣品穩定碳同位素及化學組分測定

(1)掃描與δ13C測定

將采集的根樣立即用掃描儀 (Expression 1680, ETSON) 掃描, 再用根系圖像分析軟件(Win RHIZO TRON 2005a, Regent Instruments, Canada) 對根形態參數進行測定。比根長是根長與對應根長根系干重比值。取0.005—0.006 g植物根系樣品采用MultiN/C3100德國耶拿總有機碳分/總氮分析儀(Analytik Jena AG,Germany)固體燃燒室中1050℃高溫充分燃燒后生成CO2(同時記錄樣品TOC值g/Kg),之后采用二氧化碳同位素質譜儀檢測樣品的δ13C值。植物根系的δ13C值的測定以PDB(Pee Dee Belemnite)為標準,穩定碳同位素比值據下式計算：

式中,(13C/12C)PDB為標準物質PDB的13C/12C,δ13C表示樣品13C/12C與標準樣品偏離的千分率。

(2)N濃度測定

采用凱氏定氮儀(Kjeltec 2300,Foss Tecator AB,Sweden)測定根系組織N濃度。

1.3 資料分析

試驗數據均采用Microsoft Excel 2013繪圖,在SPSS 21.0中采用線性回歸及單因素法分析根參數與根呼吸相關性。

2 結果

2.1 不同供水條件下離體根呼吸速率變化特征

如圖2,3種供水條件下,不同根系離體時間的離體根呼吸速率在2 h內呈先急劇減小,略微增大后減小,之后趨于平穩的趨勢。13C脈沖標記完成后0 h時離體,3種供水條件下根呼吸變化趨勢相似：0—20 min急劇下降,HW、MW、LW依次下降32.80%、35.18%、33.82%,在60 min左右降至最低。分別在13C脈沖標記完成6,24,48,216,360 h時離體,3種供水條件下根呼吸速率在0—20 min均有急劇下降的趨勢,下降百分比為32%—39%,各離體時間的根系呼吸速率均在60 min左右降到最低,其后變化趨于平緩。

圖2 不同供水條件下離體根呼吸隨呼吸時間的變化Fig.2 Changes of excised root respiration rates with respiration time under different water supply conditionsLW：重度脅迫,Low watered;MW：輕度脅迫,Middle watered;HW：供水充分,High watered

3種供水條件下,離體根呼吸速率在13C脈沖標記后0—48 h呈現波動性變化,48—216 h均呈現增大趨勢,之后逐漸減小。離體根呼吸速率范圍在300—450 μg g-1min-1(圖3)。其中LW處理的根呼吸速率呈現雙峰變化趨勢,在標記后0 h時最低,為356 μg g-1min-1,6 h時達到第一個峰值413 μg g-1min-1;MW處理呈現單峰變化,0—48 h呈下降趨勢,在48 h最小,為338 μg g-1min-1,216 h時達到峰值,為431 μg g-1min-1;HW處理在0 h時根呼吸速率最大,為419 μg g-1min-1,其后呈波動變化。

圖3 不同供水條件下離體根呼吸隨根離體時間的變化 Fig.3 Changes of excised root respiration rates with root excised time under different water supply conditions

2.2 不同供水條件下根呼吸釋放的δ13C變化特征

根呼吸釋放的δ13C測定的環境變化小,平均氣室溫度27—28℃,平均氣室CO2濃度為400—450 μmol/mol。

3種供水條件下,經13C脈沖標記后,不同根離體時間的根呼吸釋放的δ13C值在2h內呈先增大后減小的趨勢(圖4)。13C脈沖標記后0h離體,3種供水條件下白羊草離體根呼吸釋放的δ13C值均小于-5‰,其中HW供水條件下根呼吸釋放的δ13C均值最大;HW和MW處理的δ13C值約在0—70 min時呈逐漸上升趨勢,在70 min時達到峰值后呈緩慢降低趨勢;而LW處理的δ13C值則在45 min達到峰值。13C脈沖標記后6 h離體,根呼吸釋放的δ13C值對比0 h略增,δ13C均為負值,變化趨勢與0 h相似。13C脈沖標記后24 h離體,根呼吸釋放的δ13C上升為正值,均值從大到小依次為HW>MW>LW。13C脈沖標記后48 h離體,根呼吸釋放的δ13C對比之前的測定值,變化趨勢有較明顯改變,在LW和HW處理下根呼吸釋放的δ13C值先均呈較快上升趨勢,分別70 min和80 min達到峰值,其后逐漸下降;MW處理下δ13C值先緩慢上升,在80 min時達到峰值。13C脈沖標記后216 h離體,根呼吸釋放的δ13C值與之前對比,HW和MW處理下δ13C值變化更為劇烈,且變化趨勢和范圍相近,在0—90 min內HW處理下δ13C值從10.94‰上升到38.92‰,MW處理下δ13C值從8.91‰上升到38.02‰,其后逐漸下降;LW處理下在0—50 min內從4.30‰上升到15.68‰,其后緩慢下降;其中HW處理下根呼吸釋放的δ13C均值最大,比MW高8%,比LW高132%。13C脈沖標記后360 h離體,根呼吸釋放的δ13C對比216 h的δ13C值有明顯下降,HW處理下在100 min達到峰值19.64‰,MW處理下在90 min達到峰值16.60‰,LW在50 min達到峰值3.30‰;HW水分條件下根呼吸釋放的δ13C均值最大,比MW高10%,比 LW高714%。總體上,HW和MW處理下的δ13C值比LW后達到峰值, HW處理下δ13C均值略高于MW,與LW差值較大。

圖4 不同供水條件下根呼吸釋放的δ13C隨呼吸時間的變化Fig.4 Changes of δ13C released of root respiration with respiration time under different water supply conditions

3種供水條件下,根呼吸釋放的δ13C隨13C脈沖標記后離體時間的推移呈先增大后減小的趨勢(圖5)。3種供水條件下,13C脈沖標記后0—6 h,根呼吸釋放的δ13C均為負值,標記后48 h出現拐點,根呼吸釋放的δ13C值增長迅速,并均在216 h達到峰值,其中HW處理的根呼吸釋放的δ13C值最大,為31.46‰,比0 h時增長了417.78%,其次為MW下根呼吸釋放的δ13C,為31.46‰,比0 h時的δ13C增長了375.67%;再次是LW的δ13C值,為13.54,比0 h時增長了213.40%;標記后360 h離體測得,根呼吸釋放的δ13C急劇降低。

2.3 不同供水條件下影響離體根呼吸的根參數特征

不同供水條件下根參數的特征不同(表1)。LW處理下白羊草的總根長和總根面積顯著增加,其中總根長是HW處理總根長的2.86倍,是MW的2.60倍;總根面積約是HW和MW處理的2.7—3.0倍。對比3個水分處理下白羊草的比根長和比根面積發現,MW處理的比根長顯著大于其他兩個處理,但比根面積卻沒有顯著差異。根C含量在各個水分處理均無顯著性差異。根N含量隨供水增加而增大,碳氮比隨供水增加而減小,差異均不大。

表1 不同供水條件下白羊草根參數特征(平均值±標準誤)

LW：重度脅迫,Low watered;MW：輕度脅迫,Middle watered;HW：供水充分,High watered;小寫字母表示不同水分處理間差異顯著(P<0.5)

2.4 不同供水條件下離體根呼吸與影響因子根參數的相關性

通過對白羊草離體根呼吸速率及根呼吸釋放的δ13C影響因素做相關分析(表2)可知：在HW供水條件下離體根呼吸速率并未顯著受到根系形態及養分因子的影響,根呼吸釋放的δ13C與根系全氮呈極顯著負相關關系。在MW供水條件下,離體根呼吸速率與根呼吸釋放的δ13C、根組織δ13C三者間呈顯著相關性,但這兩個指標與根系形態及組織養分濃度并未表達出顯著相關性。在LW供水條件下,離體根呼吸速率與根面積呈顯著正相關性,與比根面積呈極顯著正相關性;根呼吸釋放的δ13C與根面積和C/N比均呈顯著正相關。

表2 不同供水條件下白羊草根呼吸與根參數的相關關系矩陣

*表示根呼吸速率與對應影響因子相關性顯著,**表示根呼吸速率與對應影響因子相關性極顯著

圖5 不同供水條件下根呼吸釋放的δ13C隨根離體時間的變化 Fig.5 Changes of δ13C released of root respiration with root excised time under different water supply conditions

3 討論

3.1 實時13CO2變化監測對準確描述離體根系呼吸的意義

離體根法和13C同位素表示法是測定根呼吸的主要方法,而根呼吸是土壤呼吸的重要貢獻之一[12],土壤呼吸CO2的釋放是對植物光合碳轉化和利用的表現[23]。本文中離體根呼吸速率在20 min內迅速下降(下降范圍32%—39%)后短暫上升,之后繼續下降,最后呼吸速率趨于平穩,這與李又芳等[24]對16年杉木細根、易志剛[15]對馬尾松和黃果厚殼桂根系、Rakonczay等[25]對紅花槭和赤櫟、Bloom等[26]對大麥的根系的離體根呼吸研究得到的結果相似,造成這一現象的原因有以下兩點：(1)細根離體后,有機物迅速分解,地上部分碳源不能及時供給,造成根系離體后呼吸速率急劇下降;(2)由于易分解有機物分解達到了相對穩定的狀態,此時根損傷刺激根際微生物活動[27],微生物活動稍有加強,但可利用的碳源缺乏,微生物的活動導致了短時間內根呼吸速率波浪變化的趨勢[28]。

通過對比前人研究我們發現,對于離體根系的CO2釋放速率可描述根系離體后根系呼吸速率的總體變化趨勢,但當說明植物光合碳在“大氣-植物-土壤”系統隨時間的分配過程和分配比例,尤其是光合產物從地上部分運送到植物根系后,根系部分光合碳隨時間的釋放過程無法采用離體根呼吸速率這一指針反映。本研究用13C脈沖標記示蹤白羊草根系接收的光合碳,用離體根呼吸釋放的δ13C研究根呼吸代謝能夠解決上述問題。本研究表明：白羊草根呼吸釋放的δ13C值隨標記后離體時間(0—360 h)的推遲呈先增大后減小的趨勢,在標記后第216 h離體測得的δ13C達到峰值。何敏毅等[29]對玉米光合碳分配研究表明根際呼吸產生的絕大部分13C都出現在標記后的216 h內,隨時間推移13C積累速率降低,Wang等[30]研究表明內蒙古典型草原13C在地上葉片光合作用產生的標記光合同化物從葉片運輸到地下根系,再由根系通過呼吸作用釋放至大氣需要約240 h,與本研究的結果一致,這說明本文提出的方法對于研究植物光合作用同化碳運輸到根系,再以根呼吸形式釋放的過程是可行的。

再者本文離體根呼吸釋放的δ13C值也受到水分脅迫的影響,表現為：根呼吸釋放的δ13C均值HW>MW>LW,當供水越充足,根呼吸釋放的δ13C的峰值出現的越遲,且峰值越大,這與任軍等[31]對不同供氮水平下水曲柳根呼吸、劉殿英等[32]對水分脅迫下的冬小麥根系、韋莉莉等[33]對杉木、嚴昌榮等[34]對暖溫帶落葉闊葉林生態系統主要喬灌木植物的光合作用產物及分配的研究結果相一致,當土壤含水量在一定閾值以下,根系呼吸速率隨著土壤水分的增加而增大,干旱處理植株各組織平均δ13C值總低于正常供水,因為供水不足會降低根系對N的吸收能力,限制苗木各器官的生長,光合效應13CO2的吸收隨之減小。以上研究表明此方法可以定量研究根系呼吸釋放的碳及其釋放特征,對定量估算植物光合產物向地下運輸的C固定和C代謝關系提供新思路支撐。

3.2 不同水分下根參數對根固碳和呼吸的影響

本研究表明,在HW供水條件下,白羊草離體根呼吸釋放的δ13C與根組織δ13C、根系全N呈極顯著負相關關系,這可能是由于水分充足時,植株生長狀況良好,地上部分光合固定的13C總量大,地下根系的固碳能力強,但土壤含水量大時根呼吸增強[35],植物生長(C固定)和根呼吸(C代謝)呈現競爭關系,此消彼長;另一方面根系對N的吸收能力隨土壤水分增大而增強[32],水分充足時,根N含量增大,離體根呼吸釋放的C量會隨之增大[24],這與根系本身固碳也形成了競爭關系,所以水分充足時離體根呼吸釋放的δ13C與根系全N呈極顯著負相關關系。

在MW供水條件下,白羊草離體根呼吸速率,與根呼吸釋放的δ13C和根組織δ13C呈顯著正相關性,是由于植物受到輕度水分脅迫,促使根系生長[32,36-37],根系下扎, 深層根相對較多,根系具有較強的吸收能力, 可促進地上器官生長發育良好,而根干重、總吸收面積、光合強度等皆呈正相關關系[32],此時光合作用固定的總13C量增加,根呼吸釋放和根組織δ13C量同時增加,輕度水分脅迫致使植物生長(C固定)和根呼吸(C代謝)同時增加。

在LW供水條件下,白羊草離體根呼吸速率與根組織δ13C、根面積、比根面積呈顯著正相關性,由于重度水分脅迫下,根系生長追逐水源,競爭碳水化合物,同化產物多分配向根系[37],白羊草通過增加根長和根面積獲取更多的土壤水分[38-39],而根系呼吸作用主要通過根表皮吸入O2和釋放CO2[40],根面積的大小會直接影響根系的呼吸效率和呼吸量[31],所以重度水分脅迫引起輸入到根系的光合碳比例增加,根組織δ13C增大,根面積的增大又導致呼吸作用增強,它們之間呈現正相關性。重度水分脅迫下,根呼吸釋放的δ13C與C/N呈顯著正相關性,重度水分脅迫導致根系對N的吸收能力降低[32],植物為了獲取足夠的氮來保證其生長, 一般通過提高向根系分配更多的碳量來促進根系的生長,目的是達到提高氮吸收能力, 也提高了根系的呼吸速率[41],這與Eissenstat和Yanai[42]提出的成本-效益(cost-benefit)理論一致,碳作為成本,在重度水分脅迫下,植株對根系的光合碳投入比例增大,根系對N的吸收能力弱導致C/N大,根呼吸釋放的δ13C增加,根系固碳量小。

本文只研究穩定碳同位素脈沖標記后光合產物在根系的釋放及固定過程,后期可定量分析植物從葉片吸收光合作用產物后的運移及釋放的整體過程,研究植物光合C在“大氣-植物-土壤”系統隨時間的分配和分配比例。

4 結論

1)3種供水條件下,不同根離體時間的白羊草離體根呼吸速率在2h內的無顯著差異,且變化趨勢一致, 0—20 min急劇下降,下降百分比為32%—39%,反映了根呼吸的速率水平。

2)穩定性碳同位素13C脈沖標記后,用根呼吸釋放的δ13C研究離體根呼吸,實時監測轉移到白羊草根系的13CO2在根部呼吸釋放的過程。3種水分條件下,根呼吸釋放的δ13C在2 h內均值大小為：供水充分>輕度脅迫>重度脅迫。隨離體時間(0—360 h)推遲根呼吸釋放的δ13C均值先增大后減小,在216 h達到峰值31.46‰。

3)3種供水條件下,離體根呼吸速率和根呼吸釋放的δ13C受根系根面積、比根面積、N含量、C/N及根組織δ13C的影響顯著。

4)輕度水分脅迫可促使根系生長(C固定)和根呼吸(C代謝)同時增加。

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