桔梗皂苷D對阿霉素體外抗肝癌活性的干預作用及其機制研究

鄭璟瑤 徐廣濤

由于肝癌的惡性程度高，肝癌細胞的轉移能力很強，因此肝癌的致死率很高，患者預后差[1]。阿霉素（多柔比星）是一種抗腫瘤抗生素，具有廣譜的抗腫瘤活性，在肝癌的化療中具有重要的作用，能明顯抑制肝癌細胞中DNA的復制和修復，從而誘導腫瘤細胞發生凋亡[2-3]。然而大劑量使用阿霉素的毒副反應，特別是對心臟的毒性也很大[4-5]。因此，采取輔助治療方法提高肝癌細胞對阿霉素的敏感性，降低其使用劑量具有十分重要的意義。本研究觀察桔梗皂苷D對阿霉素體外抗肝癌活性的干預作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RPMI-1640培養基購于美國Gibco。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（貨號：APOAF）、噻唑藍（MTT）、二氫乙啶（DHE）、桔梗皂苷D、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和阿霉素購于美國Sigma-Aldrich。ASK1抗體、磷酸化ASK1抗體和ASK1小干擾RNA購于美國Santa Cruze。活化型Caspase-3抗體、磷酸化JNK抗體和GAPDH抗體購于美國Cell Signaling。增強型化學發光底物（ECL）試劑盒（批號：32106）購于美國Pierce。脂質體2000（Lipofectamine 2000）購于美國 Invitrogen。

1.2 細胞培養 人肝癌細胞系PLC購于中科院上海細胞庫。細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，培養環境為37°C恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。

1.3 細胞活力檢測 將PLC細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、桔梗皂苷D組、阿霉素組、阿霉素+桔梗皂苷D組、阿霉素+桔梗皂苷D+NAC組和阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干擾RNA組。對照組為PLC細胞不加藥物培養48h，阿霉素組為在PLC細胞中加入0.5μmol/L的阿霉素培養48h，桔梗皂苷D組為在PLC細胞中加入1μmol/L的桔梗皂苷D培養48h，阿霉素+桔梗皂苷D組為在PLC細胞中加入0.5μmol/L的阿霉素和1μmol/L的桔梗皂苷D培養48h，阿霉素+桔梗皂苷D+NAC組為在PLC細胞中加入0.5μmol/L的阿霉素、1μmol/L的桔梗皂苷D和2mmol/L NAC培養48h，阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干擾RNA組為先將50ρmol/mL的ASK1小干擾RNA轉染入PLC細胞中培養24h，之后更換培養基再加入0.5μmol/L的阿霉素和1μmol/L的桔梗皂苷D繼續培養48h。藥物處理完畢后在PLC培養孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培養4h，小心吸去上清液，往孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長下用酶標儀檢測OD值，PLC細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

1.4 細胞凋亡 將PLC細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書用Annexin-V對細胞進行染色孵育20min。之后采用流式細胞術檢測PLC細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數占總細胞數的百分比表示。

1.5 ROS測定 將細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。藥物處理完畢后在PLC細胞中加入5μmol/L DHE暗室孵育20min。之后采用流式細胞術檢測PLC細胞活性氧（ROS）的產生。由于DHE在ROS的氧化作用下能發出紅色熒光，因此PLC細胞發出的紅色熒光越強則ROS水平越高[6]。

1.6 Western blot 將細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按上述進行分組處理。藥物處理完畢后將細胞用蛋白提取液提取總蛋白質。之后將提取的總蛋白質用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到醋酸纖維素膜上，用ASK1抗體、磷酸化ASK1抗體、活化型Caspase-3抗體、磷酸化JNK抗體或GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

1.7 統計學方法 實驗重復3次，實驗數據用均數±標準差（±s） 表示并用SPSS14.0統計軟件進行處理，組間均數的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組PLC細胞的細胞活力抑制率和凋亡誘導率比較 MTT和流式細胞實驗結果顯示，阿霉素+桔梗皂苷D組PLC細胞的細胞活力抑制率和凋亡誘導率均顯著高于阿霉素組和桔梗皂苷D組（P均＜0.05），見表 1。

表1 各組PLC細胞的細胞活力抑制率和凋亡誘導率比較（%±s）

表1 各組PLC細胞的細胞活力抑制率和凋亡誘導率比較（%±s）

注：與阿霉素組比較，▲P＜0.05；與桔梗皂苷 D 組比較，△P＜0.05；與阿霉素+桔梗皂苷D組比較，*P＜0.05

組別對照組阿霉素組桔梗皂苷D組阿霉素+桔梗皂苷D組阿霉素+桔梗皂苷D+NAC組阿霉素+桔梗皂苷D+ASK1小干擾RNA組孔數333333細胞活力抑制率0 15.2±1.4 7.2±0.5 61.5±5.1▲△25.8±2.0*19.7±1.6*凋亡誘導率1.7±0.2 7.6±0.6 2.9±0.3 36.8±2.9▲△12.4±1.1*10.8±0.9*

2.2 各組PLC細胞ASK1表達水平比較 Western blot實驗結果顯示，桔梗皂苷D處理能明顯增加PLC細胞ASK1的表達水平，而阿霉素處理對ASK1的表達水平無影響。阿霉素能誘導ASK1發生磷酸化，而桔梗皂苷D雖不能直接誘導ASK1的磷酸化，但能促進阿霉素依賴的ASK1磷酸化水平（見封四圖1）。為了判斷桔梗皂苷D發揮協同作用的機制是否與ASK1上調有關，本研究在PLC細胞中轉染ASK1小干擾RNA以沉默ASK1基因。實驗結果顯示，轉染ASK1小干擾RNA能顯著減弱桔梗皂苷D聯合阿霉素對PLC細胞活力的抑制和凋亡的誘導（P＜0.05）（見表1），表明桔梗皂苷D可能通過上調ASK1表達水平從而增強阿霉素依賴的ASK1的磷酸化，促進阿霉素對PLC細胞的殺傷活性。

2.3 阿霉素聯合桔梗皂苷D對ROS/ASK1/JNK信號途徑的影響 流式細胞實驗結果顯示，阿霉素處理能誘導PLC細胞ROS的產生，然而桔梗皂苷D對細胞內ROS的水平無影響（見封四圖2）。將PLC細胞用ROS清除劑NAC[6]處理后，阿霉素聯合桔梗皂苷D對ASK1磷酸化的誘導受到明顯抑制（見封四圖1），結果表明桔梗皂苷D聯合阿霉素對PLC的殺傷活性依賴于ROS的產生，而ROS是ASK1的上游信號分子，桔梗皂苷D雖不能直接誘導ROS的產生，但能通過上調ASK1的表達增強阿霉素依賴的ROS/ASK1信號通路。Western blot實驗結果顯示，桔梗皂苷D聯合阿霉素顯著誘導PLC細胞JNK蛋白的磷酸化，但轉染ASK1小干擾RNA后，桔梗皂苷D不能增強阿霉素依賴的PLC細胞中JNK蛋白的磷酸化（見封四圖3），桔梗皂苷D聯合阿霉素能顯著誘導PLC細胞中凋亡執行分子Caspase-3活化，而轉染ASK1小干擾RNA或采用NAC處理均能抑制Caspase-3活化（見封四圖3），表明桔梗皂苷D聯合阿霉素可能通過ROS/ASK1/JNK途徑增強阿霉素對PLC細胞凋亡的誘導。

3 討論

桔梗皂苷D是桔梗總皂苷的主要活性成分，具有抗炎、鎮痛和免疫調節的作用。文獻報道，桔梗皂苷D還具有一定的抗腫瘤活性，能促進腫瘤細胞的凋亡和周期阻滯[7-9]，然而其對化療藥物的協同抗肝癌活性至今仍很少報道。本研究發現，桔梗皂苷D聯合處理能顯著提高肝癌細胞對阿霉素的敏感性，表明桔梗皂苷D能作為一種輔助治療藥物增強阿霉素對肝癌的治療效果，降低阿霉素的使用劑量。

ROS是誘導細胞發生凋亡的重要信號分子，阿霉素等化療藥物在很大程度上通過誘導腫瘤細胞中ROS的產生，進而誘發其發生凋亡性死亡而發揮抗腫瘤活性[10-11]。在ROS誘導的信號通路中，JNK是激活細胞凋亡的重要下游分子，ROS通過激活ASK1蛋白的磷酸化誘導JNK的活化，而活化的JNK能誘導腫瘤細胞中促凋亡蛋白的表達從而誘導凋亡的發生[12-14]。本研究發現，阿霉素聯合桔梗皂苷D對肝癌細胞的殺傷活性依賴于細胞ROS的產生。桔梗皂苷D發揮協同作用的機制可能是其能上調肝癌細胞ASK1蛋白表達，從而促進阿霉素誘導產生ROS對ASK1蛋白的磷酸化，ASK1蛋白磷酸化又激活JNK的活化，從而使肝癌細胞發生了JNK依賴的細胞凋亡。

綜上所述，桔梗皂苷D對阿霉素有協同抗肝癌效應。桔梗皂苷D可能通過上調ASK1表達促進阿霉素誘導肝癌細胞發生凋亡性死亡。

［1］Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics，2015［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（1）：5-29.

［2］ Fang S，Qiu J，Guo W，et al.Down-regulation of UBC9 increases the sensitivity of hepatocellular carcinoma to doxorubicin［J］.Oncotarget，2017，8（30）：49783-49795.

［3］ Pan C，Wang X，Pan Z，et al.MiR-122 Reverses the Doxorubicin-Resistance in Hepatocellular Carcinoma Cells through Regulating the Tumor Metabolism［J］.PLoS One，2016，11（5）：e0152090.

［4］Koleini N，Kardami E.Autophagy and mitophagy in the context of doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］.Oncotarget，2017，8（28）：46663-46680.

［5］ Zhao L，Zhang B.Doxorubicin induces cardiotoxicity through upregulation of death receptors mediated apoptosis in car－diomyocytes［J］.Sci Rep，2017，16（7）：44735.

［6］ Jiang K，Wang W，Meng G，et al.Silibinin，a natural flavonoid，induces autophagy via ROS-dependent mitochondrial dysfunction and loss of ATP involving BNIP3 in human MCF7 hepatocellular carcinoma cells［J］.Oncol Rep，2015，33（6）：2711-2718.

［7］ Li T，Xu WS，Lu JJ，et al.Platycodin D induces apoptosis，and inhibits adhesion，migration and invasion in HepG2 hepatocellular carcinoma cells［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（4）：1745-1749.

［8］ Qin H，Du X，Wang R，et al.Platycodin D，a triterpenoid saponin from Platycodon grandiflorum，induces G2/M arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells by modulating the PI3K/Akt pathway［J］.Tumour Biol，2014，35（2）：1267-1274.

［9］ Dai Q，Chen Z，Wu BH，et al.Mechanism of platycodin D-induced apoptosis in A549 human lung cancer cells［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2012，37（17）：2626-2629.

［10］Wu H，Liu S，Li Y，et al.VCPA，a novel synthetic derivative of α-tocopheryl succinate，sensitizes human gastric cancer to doxorubicin-induced apoptosis via ROS-dependent mitochondrialdysfunction［J］.CancerLett，2017，1（393）：22-32.

［11］ Kim J，Shim M.COX-2 inhibitor NS-398 suppresses doxorubicin-induced p53 accumulation through inhibition of ROS-mediated Jnk activation［J］.Mol Carcinog，2016，55（12）：2156-2167.

［12］ Liang T，Zhang X，Pei J，et al.Curcumin induced human gastric cancer BGC-823 cells apoptosis by ROS-mediated ASK1-MKK4-JNK stress signaling pathway［J］.Int J Mol Sci，2014，15（9）：15754-15765.

［13］ Li HY，Zhang J，Ye ZM，et al.Celastrol induces apoptosis and autophagy via the ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma cells：an in vitro and in vivo study［J］.Cell Death Dis，2015，6（1）：e1604.

［14］Zhang L，Zhou M，Tang Y，et al.miR-92a inhibits vascular smooth muscle cell apoptosis：role of the MKK4-JNK pathway［J］.Apoptosis，2014，19（6）：975-983.