結腸癌組織ILK與E-cadherin表達及預后意義

劉 偉 楊 鵬 李于紅 洪 琛 羅華立 顧衛軍

惡性腫瘤的形成與發展是一個復雜的病理過程，涉及到多個腫瘤基因，多種致癌通路。整合素鏈接激酶（integrin-linked kinase，ILK）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶[1]。其在腫瘤形成的相關因素中處于交叉部位，并與惡性腫瘤的發展、侵犯和遷移有著密切的關系。上皮細胞鈣黏素（E-cadherin）是一種黏附分子，具有鈣依賴性，大多存在于上皮細胞中，主要在同型細胞之間起黏附反應，并在細胞骨架中起重要作用[2]，在維持細胞形態和調節細胞黏附中具有重要作用。研究[3-5]表明，ILK與E-cadherin在多種惡性腫瘤的發生發展中起重要作用。我們采用免疫組織化學方法對結腸癌組織ILK和E-cadherin表達進行檢測，探討ILK及E-cadherin表達水平與結腸癌的臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年—2016年期間于我院施行結腸癌根治性手術的50例標本，均未施行放療和化療，25例正常結腸組織標本中有15例選取距離惡性腫瘤邊緣至少5cm以上，并經病理證明為正常結腸組織，10例正常結腸組織來自良性疾病結腸部分切除標本。兩組數據符合分類變量的統計學處理原則。實驗標本采用甲醛溶液固定，所有標本石蠟包埋，標本切片厚度為4μm。50例結腸癌患者中男27例，女23例，年齡44～82歲，中位年齡57歲。腫瘤分化程度：高中分化13例，低分化37例；伴淋巴結轉移者22例，無淋巴結轉移者28例；按美國腫瘤聯合會（AJCC）制定的 Dukes分期法[6]：A+B 期 24例，C+D期26例。

1.2 主要試劑 兔抗人ILK多克隆抗體（批號16B10235）；鼠抗人E-Cadherin單克隆抗體（批號16A10609）購自北京信生元生物醫學科技有限公司。SP免疫組化檢測試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒自北京諾博萊德科技有限公司購得。

1.3 免疫組織化學染色方法 確定標本的組織學類型及分化程度行常規HE染色。50例結腸癌及25例結腸正常組織均行抗整合素連接激酶（ILK），抗E-cadherin的免疫組織化學染色，每一個蠟塊標本連續切片4～5張，厚約4μL。切片脫蠟，水化后嚴格按照S-P法試劑盒說明書步驟進行?？乖迯陀脵幟仕峋彌_液。一抗工作時濃度為1：50。運用DAB顯色試劑盒染色，對比染色采用蘇木素，封片采用中性樹膠。陰性對照采用PBS代替一抗。染色為SP法過氧化物酶標記的堿性磷酸酶染色。

1.4 結果判定 每張病理切片選擇約3個高倍視野，在每個視野中由約3個病理科醫師計數100個腫瘤細胞。整合素連接激酶（ILK）蛋白在腫瘤細胞漿中染色呈現為黃色或者為棕黃色提示為陽性，根據陽性染色細胞的百分率進行統計:如果百分率≤5%記分為0分，在6%～50%之間記為1分，50%～80%記為2分，＞80%記為3分。陰性評分為0～1分，陽性評分在2～3分之間。E-cadherin蛋白在腫瘤細胞質中染色為棕黃色為表達陽性，無染色提示陰性。采用Gofuku等[7]的判定標準，陽性細胞數＞70%判定為正常表達，＜70%提示表達異常，判定為陽性。

1.5 統計學方法 應SPSS19.0軟件，計數資料比較，采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織及結腸正常組織ILK和E-cadherin表達情況 ILK在細胞質中出現不同程度染色為黃色顆粒時提示為陽性（封三圖1）。結腸癌組ILK表達陽性率 66.0%（33/50），正常結腸組表達陽性率24.0%（6/25）。結腸癌組織ILK表達陽性率明顯高于正常結腸組（P＜0.05）。E-cadherin在結腸癌細胞質中出現黃色染色為低表達（封三圖2）。結腸癌組E-cadherin表達陽性率42.0%（21/50），正常結腸組表達陽性率96.0%（24/25），結腸癌組織E-cadnerin表達陽性率明顯低于正常結腸組（P＜0.05），見表1。

表1 結腸癌組及正常結腸組ILK和E-cadherin表達[例（%）]

2.2 ILK和E-cadherin表達與結腸癌各臨床病理因素之間的關系 統計分析顯示，ILK表達與結腸癌臨床分期及有無淋巴結轉移有關（P均＜0.05），與性別、腫瘤大小無關（P＞0.05）；雖然ILK在低分化結腸癌組織表達上調，但高、中、低分化之間差異無統計學意義（P＞0.05）。E-cadherin表達與結腸癌的臨床分期、有無淋巴結轉移以及結腸癌的分化程度均有關（P均＜0.05），但與腫瘤大小、性別無關（P＞0.05），見表 2。

表2 ILK和E-cadherin表達與各個臨床病理因素相關性[例（%）]

2.3 ILK和E-cadherin相關性分析 Spearman相關分析顯示，ILK與E-cadherin在結腸癌組織表達呈負相關（r=-0.421，P＜0.05），見表 3。

3 討論

整合素連接激酶（ILK）是一種含有多個錨蛋白重復序列的絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子大小為59KD，它的基因定位于染色體11p5.5-11p15.4。ILK可以介導細胞與細胞外基質（ECM）之間的跨膜信號轉導過程；可以參與調節控制整合蛋白、并可以參與Wnt等多條信號轉導通路。通過以上各種轉導方式進而影響細胞的增生、凋亡、細胞黏附和遷移[8]。

表3 ILK和E-cadherin表達相關性

ILK過量表達能夠促進一部分依賴性的腫瘤細胞存活。整合素是一種重要的黏附分子，ILK能提高細胞的可運動性，主要是它存在于整合素和肌動蛋白細胞骨架之間這一有利的中間位置，從而促進腫瘤的轉移。在活體外，ILK能磷酸化PKB/Akt，激活PKB傳導通路，抑制上皮細胞的凋亡。ILK激活是通過黏附到細胞外基質和磷脂酰肌醇（-3）激酶（PI3K）依賴途徑的生長因子來實現的，ILK激活促進了細胞的存活并保護抑制了細胞的凋亡。在上皮細胞中ILK的過表達導致了停泊非依賴性細胞的增長，細胞周期的延長，并且增強細胞周期蛋白A的表達，增強了細胞的致瘤性[9]，ILK表達可抑制GSK3的活性，并能增強了轉錄因子激活蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1）的活性，從而導致細胞轉移能力的增強，當ILK的高表達時，能夠導致基質金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9） 上調，MMP-9 可以通過AP-1轉錄因子途徑。MMP-9表達增加，從而參與生長因子信號通路，這些通路的激活在一定程度上可以降解細胞外基質、促進惡性腫瘤組織中血管的形成；增強了細胞運動，從而促進了惡性腫瘤的淋巴結轉移[10]。ILK還能夠磷酸化PKB Akt的Ser473，阻礙上皮細胞的凋亡，ILK是可以作用于一些磷酸化的調控元件，這些調控元件位于PKB Akt上游區，這些元件參與一些癌基因與PI3K通路，促進VEGF的表達，VEGF促進血管內皮細胞增殖、從而導致腫瘤血管的生成[11]。研究表明ILK在卵巢癌[12]、非小細胞肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]、喉鱗狀細胞癌[16]的發生發展中具有重要的作用，ILK具有癌基因的特性。本研究結果顯示，在50例結腸癌組織ILK的陽性表達率（66.0%）高于正常結腸組（P＜0.05），ILK 蛋白表達水平與臨床分期、結腸癌淋巴結轉移密切相關（P＜0.05），與結腸癌的分化程度無關（P＞0.05）。結果提示，在結腸癌組織ILK的高表達會刺激結腸癌中某些惡性腫瘤相關因子活化以及某些與惡性腫瘤擴散相關的信號轉導通路，進而促進結腸癌的發生，并促進結腸癌的轉移及侵襲，提示ILK高表達在結腸癌的轉移中起到了一定作用。

E-cadherin基因定位于16q22.1，是一種廣泛分布于上皮細胞的鈣依賴性細胞黏附分子。E-cadherin作為最重要的黏附分子，其表達異常將導致細胞的聚集、甚至侵襲和轉移，從而形成惡性腫瘤。研究[17]表明，在某些惡性腫瘤的組織E-cadherin的丟失導致細胞間接觸的減弱，進而導致組織的惡性變及惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移。本研究結果顯示，E-cadherin在正常結腸組織中高表達，而在結腸癌組織中表達率明顯降低（P＜0.05）；E-cadherin表達水平與結腸癌臨床分期分化程度，結腸癌淋巴結轉移相關（P＜0.05），表明隨著結腸癌的惡性程度進展加劇，E-cadherin表達也會有所下降，E-cadherin低表達導致細胞之間黏附減弱，從而引起結腸癌細胞發生擴散、轉移，提示E-cadherin表達異常與結腸癌的侵襲轉移等密切相關，E-cadherin低表達提示患者預后不良。

研究[18]表明，ILK能夠激活E-caherin的抑制物S-nail，從而使E-cadherin表達下調、細胞間連接減弱或消失，從而導致惡性腫瘤侵襲性的增加。本實驗結果顯示，在結腸癌組織ILK表達與E-cadherin表達呈負相關（P＜0.05），這與既往文獻報道結果一致[19]?？赡艿脑驗镮LK過表達誘導轉錄因子Snail及ZEB1表達，這個過程是通過磷酸化激活PKB來實現的，從而抑制E-caherin表達，兩者的共同反應促進結腸癌的侵犯和遷移、擴散。

總之，ILK及E-cadherin在結腸癌的發生、侵犯、轉移中起到積極的作用，兩者在結腸癌進展中相互作用。臨床上聯合檢測ILK及E-cadherin有助于評估結腸癌的生物學行為，可能是結腸癌的一個新的診斷和治療的標志。

圖1 ILK在結腸癌組織高表達（HE×200）

圖2 E-cadherin在結腸癌組織低表達（HE×200）

［1］ Gao J，Zhu J，Li HY，et al.Small interfering RNA targeting integrin-linked kinase inhibited the growth and induced apoptosis in human bladder cancer cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43（9）：1294-1304.

［2］Du WJ，Liu X，Fan GL，et al.From cell membrane to the nucleus：an emerging role of E-cadherin in gene transcription－al regulation［J］.J Cell Mol Med，2014，18（9）：1712-1719.

［3］童英，劉露，李春東，等.ILK及E-鈣黏蛋白的表達在宮頸鱗癌發病中的意義［J］.實用腫瘤學雜志，2011，25（5）：431-436.

［4］許華，李勝水，李秀清，等.原發性膽囊癌中ILK和E-cad的表達及意義［J］.中國腫瘤臨床，2013，40（19）：1170-1173.

［5］黃漢，米磊，張斌，等.涎腺腺樣囊性癌組織中ILK和E-cadherin 的表達及意義［J］.口腔頜面外科雜志，2011，21（3）：159-162.

［6］曾濤，李偉學，鐘敏.結腸癌分期對實施完整結腸系膜切除的應用價值和遠期療效［J］.實用癌癥雜志，2016，31（4）：628-631.

［7］ Gofuku J，Shiozaki H，Tsujinaka T，et al.Expression of E-cadherin and alpha-catenin in patients with colorectal carcinoma.Correlationwith cancer invasion and metastasis［J］.Am J Clin Pathol，1999，111（1）：29-37.

［8］ Zhuang X，Lv MX，Zhong ZY，et al.Interplay between intergrin-linked kinase and ribonuclease inhibitor affects growth and metastasis of bladder cancer through signaling ILK pathways［J］.J Exp Clin Cancer Res，2016，35（1）：130.

［9］ D'Amico M，Hulit J，Amanatullah DF，et al.The integrinlinked kinase regulates the cyclin D1 gene through glycogen synthase kinase 3beta and cAMP-responsive element binding protein-dependent pathways［J］.J Biol Chem，2000，275（42）：32649-32657.

［10］ Zhao MJ，Gao Y，Wang LL，et al.Overexpression of Integrin-linked Kinase Promotes Lung Cancer Cell Migration and Invasion via NF-κB-mediated Upregulation of Matrix Metalloproteinase-9［J］.Int J Med Sci，2013，10（8）：995-1002.

［11］Perera PM，Wypasek E，Madhavan S，et al.Mechanical signals control SOX-9，VEGF，and c-Myc expression and cell proliferation during inflammation via integrin-linked kinase，B-Raf，and ERK1/2-dependent signaling in articular chondrocytes［J］.Arthritis Res Ther，2010，12（3）：1-9.

［12］Bruney L，Liu Y，Grisoli A，et al.Integrin-linked kinase activity modulates the pro-metastatic behavior of ovarian cancer cells［J］.Oncotarget，2016，7（16）：21968-21981.

［13］ Zhao XZ，Xu ZY，Wang ZQ，et al.RNA silencing of integrin-linked kinase increases the sensitivity of the A549 lung cancer cell line to cisplatin and promotes its apoptosis［J］.Mol Med Rep，2015，12（1）：960-966.

［14］ Zhao G，Guo LL，Xu JY，et al.Integrin-linked kinase in gastric cancer cell attachment，invasion and tumor growth［J］.World J Gastroenterol，2011，17（30）：3487-3496.

［15］ Pang MF，Siedlik MJ，Han S.Tissue Stiffness and Hypoxia Modulate the Integrin-Linked Kinase ILK to Control Breast CancerStem-like Cells［J］.Cancer Res，2016，76（18）：5277-5287.

［16］Wu PA，Li SS，Tang QL，et al.Clinical significance of integrin-linked kinase in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Auris Nasus Larynx，2017，44（4）：458-463.

［17］ Li LI，Lv Y，Zhang Y.Expression and clinical significance of Oct-4 and E-cad in non-small-cell lung cancer［J］.Oncol Lett，2016，11（1）：234-236.

［18］Schaeffer DF，Assi K，Chan K，et al.Tumor expression of integrin-linked kinase（ILK）correlates with the expression of the E-cadherin repressor snail：an immunohistochemical study in ductal pancreatic adenocarcinoma［J］.Virchows Arch，2010，456（3）：261-268.

［19］ Yu J，Shi R，Zhang D，et al.Expression of integrin-linked kinase in lung squamous cell carcinoma and adenocarcinoma：correlation with E-cadherin expression，tumor microvessel density and clinical outcome［J］.Virchows Arch，2011，458（1）：99-107.