豬圓環病毒Ⅱ型 （PCV2）分離培養與鑒定

李思佳 張鶴

（1，北京市第一七一中學 100013；2，中國科學院微生物研究所 100080）

2013年3月，黃浦江松江段水域發生漂浮死豬事件，上海市動物疫病預防控制中心現場采集了死豬內臟樣品進行檢測，從一份樣品中檢出豬圓環病毒。我國自從2000年郎洪武首次報道檢測出PCV2抗原以來，浙江、北京、四川、黑龍江等省也報道有PCV2的感染[1]。

豬圓環病毒 （Porcine Circovirus，PCV）是迄今發現的最小的動物病毒之一。現已知PCV有兩個血清型，豬圓環病毒I型 (PCV1)和Ⅱ型 (PCV2)。PCV1為非致病性病毒，PCV2為致病性病毒，本實驗對象為PCV2。PCV2與豬群中發生的多種疾病相關，其可引起奶仔豬多系統衰竭綜合征 (PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征 (PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征 (RDC)、豬先天性振顫等疾病[1]。目前，豬圓環病毒病及其相關性疾病在我國豬病中所占的主導地位愈發明顯。因PCV2具有免疫抑制特性，從而使感染豬不能對其他疫苗或病原體產生有效的免疫應答，對其他疾病的易感性增強，易誘發混合感染，導致癥狀更為復雜。為減少豬圓環病毒Ⅱ型 （PCV2）的發生，降低養殖戶經濟損失，對PCV2的研究尤為重要。

1 材料

實驗材料：細胞培養液 (90%DMEM+10%胎牛血清+0.1%抗生素)、無血清培養液 （100%DMEM）、PBS緩沖液(1LH2O： 8gNaC1+0.2gKC1+3.58gNa2HPO4·12H2O+0.24gKH2PO4)、病豬的肺臟組織、胰酶、DNA提取盒、5%CO2培養箱、電泳儀，PCR擴增儀

2 PCV2病毒

PCV2病毒是國際病毒分類委員會 (ICTV)第六次分類學術報告新增的圓環病毒科 (Circoviridae)，圓環病毒屬 (Circovirus)的成員，PCV2是圓環病毒屬的代表種，是目前發現的最小的脊椎動物病毒[1]。PCV是己知的能在哺乳動物細胞中進行自我復制的最小病毒，是一種無囊膜、單鏈環狀DNA病毒[2]。

3 PK-15細胞

3.1 PK-15細胞

PK-15細胞為豬腎上皮細胞，來源于豬腎，該細胞對多種病毒比較敏感，如PCV、豬細小病毒 （PPV）、豬瘟病毒（CSFV） 等。

PK-15細胞系是體外培養PCV2的良好宿主細胞，把PCV2接種到沒有污染的單層PK-15細胞上可以獲得良好的病毒增殖[1]。病毒在細胞中的復制需依賴細胞生長周期S期的細胞表達蛋白，同時組織細胞的增殖為PCV2復制及擴散提供最佳條件，病毒的體外增殖實驗中，只有當細胞已經過有絲分裂期后病毒才開始復制。病毒在感染PCV的PK-15細胞內主要以胞漿內包涵體形式存在,少數感染細胞內還可觀察到核內包涵體[3]。

3.2 PK-15細胞傳代培養

提前15～20min在37℃溫水中加熱細胞培養液、PBS緩沖液、胰酶；點燃酒精燈；從37℃5%CO2培養箱中拿出已培養48h PK-15細胞的培養皿，棄掉原有的培養液；培養皿中加入5m1PBS，稍微搖動，棄掉液體；再加入5m1胰酶，放入37℃5%CO2培養箱中3min，棄掉胰酶，再放入37℃5%CO2培養箱中2～3min，拿出并輕拍皿沿 （觀察PK-15細胞掉落情況）；加6m1培養液，用吸管輕輕吹打并吹散細胞，分為3份，取一份放入新培養皿 （已提前放入8m1培養液）中培養，放入37℃5%CO2培養箱繼續培養48h。

4 PCV2病毒PCR檢測

4.1 提取病料的DNA

豬肺臟組織先打碎后研磨成勻漿，加入生理鹽水，制成組織懸液，離心，取上清液進行DNA提取。

（1）上清液中加入 20μ1Proteinase K溶液，混勻，加200μ1緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

（2）加入200μ1無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

（3）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中 （吸附柱CB3放入收集管中），12000r/min離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

（4）向吸附柱CB3中加入500μ1緩沖液GD，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

（5）向吸附柱CB3中加入600μ1漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中 （此操作重復2遍）。

（6）將吸附柱 CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

（7）將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加60μ1洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5min，12000r/min離心2min，將溶液收集到離心管中。

4.2 PCR檢測

（1）PCV2型病毒檢測引物：Forward：5’-AGTGAGCG GGAAAATGCAGA-3’； Reverse： 5’ -TCCTCCGTGGATTGTT CTGT-3’，此引物可以擴增出PCV2ORF1（開放式閱讀框，Open Reading Frame）中大小為391bp的DNA片段。

（2）檢測3組樣品，分別為病毒組、對照組和水。

20μ1PCR擴增反應體系：

（3）PCR擴增程序如下：

反應完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，根據擴增片段大小，判定病毒感染情況。

5 PCV2病毒分離與鑒定

5.1 PK-15細胞傳代

按照3.2進行PK-15細胞傳代。

5.2 病毒接種

將PCR檢測結果為陽性的病料研磨后凍融3次，上清用0.22μm的細菌濾器過濾除菌。將已生長24h的PK-15細胞棄去原有培養液，加入5m1無血清培養液，將培養液與病毒濾液按體積比25∶1的比例進行混合，即5m1無血清培養液中加入200μ1病毒濾液，于37℃條件下培養2h，期間每半小時搖一次培養皿，幫助病毒附著到細胞上。2h后再加入無血清生長液繼續培養72h。培養過程中同時設立不接毒的細胞培養物作為陰性對照。

5.3 收集病毒

將接毒并培養72h后的PK-15細胞在-80℃反復凍融2次，20000r/min離心10min取上清液。

5.4 病毒傳代

5.4.1 傳代步驟

（1）用0.22μm細菌過濾器過濾病毒，放入新的離心管。

（2）吸出兩個PK-15細胞培養皿中的培養液，用PBS清洗一遍。

（3）兩個PK-15細胞培養皿中各加5m1無血清培養液，取200μL病毒濾液接入其中一皿中，晃勻，放入37℃ 5%CO2培養箱中，每30min拿出搖一次。

（4）接入病毒2h后，棄掉培養液，重新加10m1無血清培養液，無病毒則直接再加5m1無血清培養液，放入37℃5%CO2培養箱中。

72h后，取第一代培養物 （F1）,再接種處于分裂期的PK-15細胞，同時設不接種病毒的PK-15細胞作陰性空白對照，連傳3代。傳代過程中PCR檢測PK-15細胞中PCV2增殖情況。

5.4.2 出現的問題及改進措施

實驗過程中，由于 （3）中接入的病毒濾液體積過少，導致病毒增殖較少，因此將 （3）中的200μ1病毒濾液改為500μ1病毒濾液。

5.5 PCV2病毒DNA的提取

按照步驟4.1.2提取PCV2病毒DNA。

5.6 PCR鑒定

以提取病毒DNA為模板，用PCV2型特異性檢測引物Forword/Reverse進行PCR鑒定。病毒通過電泳圖像顯示病原是否為陽性。

5.7 基因序列測定

PCV2 ORF1基因序列測定由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。結合相關文獻資料，分析PCV2 ORF1基因的序列及所編碼的核苷酸，與己發表的基因序列比較同源性。

6 病毒提純

將收獲的病毒培養液在12000g離心30min，除去細胞碎片和較大的雜質。將上清液加入盛有300g/L蔗糖墊的離心管中，150000g離心3h；棄去上清液，用0.01mmo1/L pH8.0的TE緩沖液重懸并收集病毒。

7 實驗結果

7.1 PK-15細胞的培養結果

經過多次傳代的PK-15細胞生長狀況良好，增殖率高，參見圖1。

圖1 PK-15

7.2 接種病毒體積對于病毒增殖的影響

在病毒傳代時，最初無血清培養液與病毒濾液的體積比為25∶1，即5m1無血清培養液中接入200μ1病毒濾液，結果病毒增殖情況不理想。后改為無血清培養液與病毒濾液體積比為10∶1，即5m1無血清培養液中接入 500μ1病毒濾液，改變病毒濾液接入量后病毒增殖情況良好。

7.3 PCV2型特異性DNA片段的PCR檢測結果

采用病料中提取的DNA作為模板，用Forward,Reverse引物進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增的PCR產物，結果獲得一條長度為417bp的電泳條帶，擴增產物結果與預期片段大小相符，說明病料組織中含有PCV2，參見圖2。

7.4 病毒分離培養結果

將PCR檢測陽性的組織勻漿接種于PK-15細胞，進行3次傳代。結果表明，F1～F3病毒用PCV2型特異性引物均可擴增獲得PCV2的特異性目的片段，說明病毒已在PK-15細胞中增殖。病毒通過電泳圖像均顯示陽性，見圖3，說明病毒培養成功。

圖3 病毒電泳條帶結果

7.5 序列測定與分析結果

7.5.1 PCV2毒株ORF1基因的測序結果

PCV2毒株ORF1基因的測序結果見下。經測序：PCV2的ORF1基因序列為391個堿基組成，大小和預期結果一致。

7.5.2 PCV2毒株核苷酸序列比較結果 （相同核苷酸用 “……”表示）。

結果顯示，PCV2的ORF1基因核苷酸序列和國內己發表毒株ORF1基因相比較，核苷酸序列同源性為94.6%。

8 結論

PK-15細胞是體外培養PCV2病毒的敏感細胞，把PCV2接種到無PCV感染的PK-15細胞上能獲得最好的病毒增殖，但不產生細胞病變。在病毒傳代時通過改變無血

清培養液與病毒濾液的比例，得出無血清培養液與病毒濾液體積比為10∶1時病毒增殖情況較好。

將PCR檢測呈陽性的病料接種到PK-15細胞連續傳代，接種后1～3代細胞培養物用PCV2型特異性引物檢測結果呈陽性，說明PCV2病毒己在PK-15細胞中增殖。最后將病毒純化分離，進行測序鑒定，從而確定其為PCV2分離株。

本實驗根據PCV2的培養特性，使其在適應細胞PK-15上成功繁殖并傳代，達到從原始病料中分離病毒的目的。

9 研究前景

PCV2感染和引起的疾病己成為全球養豬生產中的大問題。目前，各國對PCV2感染沒有有效的防治方法，普遍采取的措施是控制繼發感染，在做好豬場的衛生消毒工作、降低或避免應激因素、提高飼養管理水平和斷奶仔豬營養水平的基礎上，重點控制繼發感染，最大限度地降低死亡率，減少經濟損失。本實驗通過PK-15細胞分離鑒定了一株PCV2病毒株，用此病毒株再進行數次傳代培養，不斷弱化其毒性，可作為活疫苗使用，為以后開發PCV2的弱毒活疫苗奠定基礎。

[1]丁婷婷.豬圓環病毒2型的分離鑒定及其人工感染試驗[D].揚州:揚州大學,2012.

[2]盧權威,郭官鵬,崔保安,等.2株豬圓環病毒2型的分離鑒定及全基因組序列分析[J].西北農林科技大學學報（自然科學版）,2013,9(3):44-48.

[3]王永祥.豬圓環病毒2型山東株的分離鑒定及其DRF2基因的克隆與表達[D],濟南:山東農業大學,2008.