表皮型脂肪酸結合蛋白-5基因沉默對人卵巢癌細胞 A2780增殖、凋亡及侵襲力的影響

李 霞 劉世凱

(滄州市中心醫院婦一科，河北 滄州 061001)

卵巢癌發病率僅低于子宮內膜癌和宮頸癌，其死亡率則居于婦科疾病第一位〔1～3〕。由于卵巢癌在發病初期缺乏特定的征象，因此該疾病在診斷時確診非常之困難。往往在確診時患者病情已經發展到了進展期或者晚期，臨床上卵巢癌的治療多以手術切除輔以放療和化療；這也給患者生理上造成了巨大的損傷和影響。表皮型脂肪酸結合蛋白(FABP)-5能夠通過脂肪酸代謝產物調控腫瘤細胞信號轉導，促進細胞的增殖活化；國內外諸多研究發現該蛋白表達水平在原發性肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等細胞進行異常增殖活動時顯著上調〔4～10〕。此外，FABP-5的異常表達對膽管細胞癌和口腔鱗狀細胞癌侵襲力有顯著上調作用〔11～13〕。周玲麗等〔14,15〕成功通過RNA干擾技術沉默人肝癌細胞FABP-5基因，成功阻斷了細胞有絲分裂，有效抑制其增殖活性及其侵襲力。該研究表明FABP-5可能是癌癥治療的一個重要靶點。本文探討FABP-5基因沉默對人卵巢癌A2780細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料及來源 胰蛋白酶購自美國Sigma公司；細胞培養箱購自Heraeus Sepatech 公司。DMEM培養基、胎牛血清和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自Hyclone，Trizol試劑盒購自Invitrogen；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測試試劑盒(增強型)、5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、20×三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)緩沖液等購自南京建成生物。兔抗人FABP-5抗體購于北京百邁客生物科技有限公司，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于艾康生物技術(杭州)有限公司。生理鹽水從上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院購進。本試驗細胞處理等過程中使用的超凈工作臺由藝斯高上海貿易有限公司提供。

1.2人卵巢癌細胞A2780體外培養模型建立及實驗分組 將自中國醫學科學院購進的凍存卵巢癌A2780細胞置于60℃恒溫水浴箱，30 s內進行細胞的快速復蘇。融化之后將細胞迅疾轉入EP管并加入DMEM培養基，重復小心吹打細胞使其在培養基中均勻分布。將復蘇后的細胞用LG-DMEM完全培養基調整為1×106/ml的密度培養。將處于對數生長期的細胞分為三組，分別為FABP-5 siRNA組、陰性對照組、空白對照組。FABP-5 siRNA組細胞瞬時轉染FABP-5 siRNA，陰性對照組細胞瞬時轉染空載質粒；空白對照組細胞不進行任何處理。

1.3基因轉染 單鏈DNA oligo引物退火配對形成雙鏈DNA后，通過其兩端所含酶切位點直接連入酶切后的RNA干擾慢病毒載體上。將連接產物轉入制備好的細菌感受態細胞，對長出的單克隆菌落先進行PCR鑒定，PCR鑒定陽性菌落進行測序鑒定，測序結果比對正確的克隆即為構建成功的目的基因RNA干擾慢病毒載體。包裝制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒，備用于細胞轉染。

基因轉染前，胰酶消化取出的細胞，將之制成5×104/ml細胞懸液并接種于6孔板，置于細胞培養箱中進行培養。陰性對照組加入空載載體(LV-shRNA-NC)，空白對照組常規培養。待細胞融合度達到20%～30%進行轉染，每孔均加入Polybrene及感染增強液，轉染的感染復數(MOI)為10。每組均設3個重復孔。轉染96 h后熒光最強，轉染后4～5 d收獲細胞。

1.4逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測FABP-5 mRNA水平的表達 取三組細胞，進行RT-PCR反應檢測表皮型脂肪酸結合蛋白(FABP)-5基因表達和Western印跡進行其蛋白表達水平的試驗。每個檢測重復3次。通過Primer Primer5.0軟件設計引物，FABP-5上游引物：5′-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3′，下游引物：5′-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3′，擴增片段212 bp；內參GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增片段121 bp。提取細胞RNA并逆轉錄為cDNA，采用2-ΔΔCt分析法，GAPDH基因作為內參，2-ΔΔCt即反映FABP-5 mRNA相對表達水平。檢測目的基因FABP-5 mRNA的表達情況。

1.5Western印跡檢測FABP-5蛋白水平的表達 取三組細胞，根據BCA試劑盒(購自北京益德益華生物有限公司)提取并測定三組細胞蛋白濃度，簡而言之：將細胞裂解并將其稀釋至相同的蛋白濃度，100℃煮沸5 min使蛋白變性。每組取蛋白40 μg，行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(70 V，30 min；100 V，90 min)；轉膜(200 mA，3 h)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過夜)；一抗1∶500，室溫孵育2 h(或4℃過夜)；四聚丙烯(烷基)苯磺酸鹽(TPBS)洗滌3次，PBS洗滌1次；之后進行Western印跡的反應，拍照記錄之后進行軟件的圖像分析，測定三組細胞中FABP-5蛋白質相對表達水平。

1.6細胞計數試劑盒(CCK)-8法測定細胞體外增殖能力 在人卵巢癌A2780細胞經過FABP5 siRNA和空載質粒轉染后繼續將之培養，分別測定轉染48 h后細胞的增殖活化能力。對三組細胞分別采用CCK-8法各組細胞的增殖活化能力，簡而言之：轉染48 h之后，將三組細胞分別收集接種到細胞培養96孔板上，每個處理3個重復；細胞培養箱中培養至細胞貼壁后繼續培養48 h后，向各個孔中分別加入20 μl CCK-8試劑后振蕩均勻；放入細胞培養箱繼續進行培養1 h，之后取出酶標儀測定OD 490 nm的吸光度值。

1.7流式細胞技術檢測各組細胞周期和凋亡的變化情況 細胞轉染之后繼續培養48 h，將各組卵巢癌細胞從細胞培養箱中取出。各組人卵巢癌A2780細胞分別采用碘化丙啶(PI)染色后通過流式細胞法檢測各個實驗組細胞周期分布和細胞凋亡率變化。首先配置染色劑PI〔含有50 mg/L PI，20 mg/L核糖核酸酶(RNase)A，1 g/L枸椽酸鈉，pH 7.4〕，4℃避光保存。取出轉染后培養48 h的三個處理組細胞，PBS洗滌幾次后吹打重懸，使細胞密度達到約5×105個/ml；用-20℃預冷、終濃度為75%的乙醇溶液進行細胞固定，-20℃放置過夜；取出固定完畢的細胞樣品，離心棄上清后加入預冷的PBS，再次離心棄上清收集細胞；加入核糖核酸酶A試劑重懸細胞消化30 min，再加入PI溶液，4℃黑暗處理條件下染色30 min。將細胞樣品轉移到流式細胞儀的檢測管中進行上機檢測，根據細胞有絲分裂各個時期DNA含量的變化規律進行細胞周期分布和細胞凋亡率的檢測。

1.8沉默FABP-5基因對A2780細胞遷移、侵襲能力的影響 人卵巢癌 A2780細胞的遷移能力進行測定，轉染后，用10 μl加樣槍尖在每個細胞培養孔內劃痕(作為0 h)；用記號筆在細胞培養板底部隨機標記5個觀察點，PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞；加入無血清的DMEM培養液，繼續培養細胞36 h后，在光學顯微鏡下觀察細胞的劃痕愈合能力。重復3次。將凍存于-20℃冰箱的Matrigel膠提前1 d 4℃過夜融化，鋪膠。向三組卵巢癌細胞中加入無血清DMEM培養基制成4×105/ml細胞懸液；將細胞懸液加入細胞侵襲實驗小室，并小心將其放置入24孔板孔之中。在孵育箱中孵育24 h后取出小室，將之放于甲醇液中固定15 min下室面，進行蘇木素-伊紅染色，高倍鏡計數細胞數。重復3次。

1.9統計學處理 應用SPSS11.0 軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1FABP-5 mRNA水平的表達 空白對照組(1.68±0.25)與陰性對照組(1.57±0.26)卵巢癌細胞中FABP-5 m RNA相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。但與此二組相比，FABP-5 siRNA組 FABP-5基因表達水平(0.87±0.27)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組FABP-5 mRNA表達電泳圖

2.2FABP-5蛋白水平的表達 空白對照組(2.68±0.25)和陰性對照組細胞中FABP-5蛋白相對表達水平(2.59±0.24)差異無統計學意義(P>0.05)。FABP-5 siRNA組中FABP-5蛋白相對表達水平(1.47±0.28)顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見圖2。

2.3細胞體外增殖能力 與空白對照組(0.901±0.049)和陰性對照組(0.896±0.048)相比，FABP-5 siRNA組細胞增殖水平(0.213±0.022)顯著降低(P<0.05)；與空白組和陰性對照組相比，基因沉默組分別降低了76.8%和76.9%。

圖2 各組FABP-5蛋白表達電泳圖

2.4細胞周期和凋亡的變化情況 空白對照組與陰性對照組相比，有絲分裂期各個時期細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)。與陰性對照組和空白對照組相比，FABP-5 siRNA組細胞的生長速度明顯減慢，細胞周期阻滯在G0/G1期，S期細胞數減少(P<0.05)；與陰性對照組和空白對照組相比，FABP-5 siRNA組細胞的凋亡率明顯升高(P<0.01)。見表1。

2.5細胞遷移及侵襲能力 空白對照組〔(89.38±2.63)%〕與陰性對照組細胞遷移率〔(90.42±2.43)%〕差異無統計學意義(P>0.05)，但是FABP-5 siRNA組〔(14.40±2.52)%〕則顯著降低，較二者分別降低75%和76%。見圖3。空白對照組〔(65.38±2.15)%〕和陰性對照組〔(64.87±2.43)%〕細胞的侵襲率，差異無統計學意義。而細胞FABP-5 siRNA組轉染后細胞侵襲率〔(42.10±2.07)%〕較其他兩組顯著降低(P<0.05)。見圖4。

表1 各組細胞周期和凋亡的變化情況

與空白對照組、陰性對照組：1)P<0.05，2)P<0.01

圖3 各組卵巢癌A2780細胞遷移能力(×200)

圖4 各組卵巢癌A2780細胞侵襲能力(×200)

3 討 論

FABP是細胞內協調脂質代謝反應的一個蛋白家族，與機體代謝和炎癥通路也密切相關〔16～19〕。FABP可高親和性地與疏水性基團，如長鏈脂肪酸等脂類物質可逆性結合；其在脂質代謝旺盛的組織細胞中(如肝細胞等)表達最為強烈，其參與脂肪酸代謝〔20～23〕。該家族根據不同的組織表達差異性，分為9個成員，其中FABP-5主要來源于表皮細胞；主要調控細胞內信號轉導和基因表達〔24〕，結合并轉運維甲酸，活化過氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)β/δ，是細胞內源性的抗氧化物質，調節細胞分化，促進增殖并抑制凋亡〔14〕。本研究提示載體構建和細胞轉染是成功的。通過基因沉默FABP-5的表達，顯著降低了卵巢癌細胞的增殖活性，提高了細胞的凋亡率，并將細胞阻滯在DNA合成前期。

研究表明在乳腺癌細胞、肺鱗癌細胞〔10，25，26〕增殖過程中FABP-5基因顯著上調，這提示FABP-5可能與其增殖活性相關。研究顯示FABP-5基因上調可能提高了肝癌細胞的增殖和轉移能力〔27，28〕；有研究通過慢病毒RNA干擾FABP-5基因，顯著降低了肝癌細胞的增殖，促進其凋亡〔14，15〕。本研究首次表明，FABP-5基因沉默可抑制人卵巢癌細胞的增殖活化。FABP-5可與細胞核內的PPARβ/δ和維甲酸X受體(RXR)結合為PPRE啟動原件，激活促進細胞增殖生長的PDK1和抑制細胞凋亡分化的Akt信號通路，提高細胞的增殖活化能力〔29〕。腫瘤細胞與正常細胞的主要區別除了細胞增殖失控外，還表現在腫瘤細胞具有特殊的侵襲和遷移的能力〔30～32〕。本試驗結果表明，對癌細胞的擴散起到顯著的抑制作用。Jing等〔33〕通過給前列腺癌模型大鼠轉導FABP-5轉染子，顯著增加了模型大鼠的腫瘤和轉移灶的數量；這提示FABP-5對誘導腫瘤細胞侵襲遷移有重要促進作用；FABP-5的這一特性在其他腫瘤細胞的增殖和轉移活性研究中也得到了證實〔34，35〕。

這可能與FABP-5介導的鈣離子信號傳導通路和細胞黏附分子表達有關，研究顯示FABP-5可捕獲鈣連接蛋白并與之形成復合體，定向性地轉運到細胞周邊，降低細胞黏附分子的表達和分泌〔29〕，黏附分子的缺乏提高了癌細胞的浸潤性。本試驗通過基因沉默FABP-5的表達，降低了人卵巢癌細胞增殖活化能力和侵襲遷移活性，FABP-5 siRNA基因轉染可能是治療宮頸癌的有效方法。

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